En Ex Vivo Brain Slice-modell för att studera och rikta bröstcancer Hjärnans metastatiska tumörtillväxt
Summary
Vi introducerar ett protokoll för att mäta läkemedels- och strålningsrespons i realtid av bröstcancerhjärnmetastatiska celler i en organotypisk hjärnskiva modell. Metoderna ger en kvantitativ analys för att undersöka de terapeutiska effekterna av olika behandlingar på hjärnmetastaser från bröstcancer på ett ex vivo-sätt inom hjärnans mikromiljögränssnitt.
Abstract
Hjärnmetastaser är en allvarlig konsekvens av bröstcancer för kvinnor eftersom dessa tumörer är svåra att behandla och är förknippade med dåliga kliniska resultat. Prekliniska musmodeller av bröstcancer hjärnmetastatisk (BCBM) tillväxt är användbara men är dyra, och det är svårt att spåra levande celler och tumörcellsinvasion i hjärnparenkymen. Här presenteras ett protokoll för ex vivo hjärnskiva kulturer från xenograferade möss som innehåller intrakraniellt injicerade bröstcancer hjärnsökande klonala sublinjer. MDA-MB-231BR luciferasmärkta celler injicerades intrakraniellt i hjärnan hos Nu / Nu-honmöss, och efter tumörbildning isolerades, skivades och odlades hjärnorna ex vivo. Tumörskivorna avbildades för att identifiera tumörceller som uttrycker luciferas och övervaka deras spridning och invasion i hjärnparenkymen i upp till 10 dagar. Vidare beskriver protokollet användningen av time-lapse-mikroskopi för att avbilda tumörcellernas tillväxt och invasiva beteende efter behandling med joniserande strålning eller kemoterapi. Tumörcellernas svar på behandlingar kan visualiseras genom levande avbildningsmikroskopi, mätning av bioluminescensintensitet och utförande av histologi på hjärnskivan som innehåller BCBM-celler. Således kan denna ex vivo-skivmodell vara en användbar plattform för snabb testning av nya terapeutiska medel ensam eller i kombination med strålning för att identifiera läkemedel som är anpassade för att rikta in sig på en enskild patients bröstcancerhjärnmetastatisk tillväxt i hjärnans mikromiljö.
Introduction
Bröstcancer hjärnmetastaser (BCBM) utvecklas när celler sprids från den primära brösttumören till hjärnan. Bröstcancer är den näst vanligaste orsaken till hjärnmetastaser efter lungcancer, med metastaser som förekommer hos 10-16% av patienterna1. Tyvärr förblir hjärnmetastaser obotliga eftersom >80% av patienterna dör inom ett år efter deras hjärnmetastasdiagnos, och deras livskvalitet försämras på grund av neurologiska dysfunktioner2. Det finns ett akut behov av att identifiera effektivare behandlingsalternativ. Monolayer tvådimensionella eller tredimensionella odlingsmodeller är de vanligaste metoderna för att testa terapeutiska medel i laboratoriet. De efterliknar dock inte den komplexa BCBM-mikromiljön, en viktig drivkraft för tumörfenotyp och tillväxt. Även om dessa modeller är användbara, fångar de inte de komplexa tumör-stromainteraktionerna, de unika metaboliska kraven och heterogeniteten hos tumörerna3. För att mer troget rekapitulera tumör-stroma-interaktioner och mikromiljö heterogenitet har vår grupp och andra börjat generera organotypiska hjärnmetastaser “skiva” kulturer med patient-härledda tumörceller (primära eller metastatiska) eller cancercellinjer 4,5,6. Jämfört med klassiska in vitro-system kan denna kortsiktiga ex vivo-modell ge mer relevanta förutsättningar för screening av nya terapier före preklinisk bedömning i stora djurkohorter.
Ex vivo-modeller har konstruerats och framgångsrikt använts främst för att identifiera framgångsrika behandlingar av olika cancerformer. De kräver några dagars bedömning och kan dessutom skräddarsys för patientspecifik läkemedelsscreening. Till exempel har humana urinblåse- och prostatacancer ex vivo-vävnader visat ett dosberoende antitumörsvar av docetaxel och gemcitabin7. Liknande kolorektalkarcinom ex vivo-vävnader utvecklades för att screena kemoterapeutiska läkemedel Oxaliplatin, Cetuximab och Pembrolizumab8. Denna applikation har använts i stor utsträckning vid bukspottkörtelcancer, med tanke på den väsentliga interaktionen mellan stromamiljön och de genotypiska och fenotypiska egenskaperna hos bukspottkörtelkanal adenokarcinom 9,10. Vidare har sådana organotypiska modeller utvecklats för liknande screeningar i huvud-, nack-, mag- och brösttumörer11,12.
Här genereras en ex vivo hjärnskiva modell av xenografted bröstcancer hjärnmetastatiska tumörceller i deras mikromiljö. Möss injicerades intrakraniellt med bröstcancer hjärnmetastatisk hjärna trofisk MDA-MB-231BR celler13 i hjärnbarken parietallob- en vanlig plats för TNBC-metastasering14,15 och fick utveckla tumörer. Hjärnskivor genererades från dessa xenograferade djur och upprätthölls ex vivo som organotypiska kulturer enligt beskrivningen16,17. Denna nya ex vivo-modell möjliggör analys av BCBM-cellens tillväxt i hjärnans parenkym och kan användas för att testa terapeutiska medel och strålningseffekter på tumörceller i hjärnans mikromiljö.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie etablerar en ny ex vivo hjärnodlingsmetod för explanterade xenograft hjärntumörer. Vi visar att BCBM-celler MDA-MB-231BR-celler intrakraniellt injicerade i hjärnan hos möss kan överleva och växa i ex vivo hjärnskivor. Studien testade också intrakraniellt injicerade U87MG glioblastom (GBM) celler och fann också att dessa cancerceller överlever och växer i hjärnskivor (data visas inte). Vi tror att denna modell kan utökas bortom BCBM och GBM till andra cancerformer som lätt me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Julia Farnan, Kayla Green och Tiziana DeAngelis för deras tekniska hjälp. Detta arbete stöddes delvis av Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) och WW Smith Charitable Trusts (EjH).
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel’s mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice–a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).
