5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin/Fosfo-Histone H3 Dobbeltmærkning protokol for Cell Cycle Progression Analyse i Drosophila neurale stamceller
Summary
Cellecyklusanalyse med 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) og fosfo-histone H3 (pH3) mærkning er en flertrinsprocedure, der kan kræve omfattende optimering. Her præsenterer vi en detaljeret protokol, der beskriver alle trin for denne procedure, herunder billedanalyse og kvantificering for at skelne celler i forskellige cellecyklusfaser.
Abstract
In vivo cellecyklus progression analyse udføres rutinemæssigt i undersøgelser af gener, der regulerer mitose og DNA-replikation. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) er blevet brugt til at undersøge replikativ/S-fase progression, mens antistoffer mod fosfo-histone H3 er blevet brugt til at markere mitotiske kerner og celler. En kombination af begge etiketter vil gøre det muligt at klassificere G0/G1 (Gap fase), S (replikativ), og M (mitotisk) faser og tjene som et vigtigt redskab til at vurdere virkningerne af mitotiske gen knockdowns eller null mutanter på celle cyklus progression. De reagenser, der anvendes til at mærke EDU-mærkede celler, er imidlertid uforenelige med flere sekundære antistof-fluorescerende tags. Dette komplicerer immunstaining, hvor primære og mærkede sekundære antistoffer bruges til at markere pH3-positive mitotiske celler. Dette papir beskriver en trin-for-trin protokol for dual-mærkning af EdU og pH3 i Drosophila larval neurale stamceller, et system, der anvendes i vid udstrækning til at studere mitotiske faktorer. Derudover er der fastsat en protokol til billedanalyse og kvantificering for at allokere mærkede celler i 3 forskellige kategorier, G0/G1, S, S>G2/M (progression fra S til G2/M) og M-faser.
Introduction
Celledelingscyklussen omfatter en G1-fase (første hulfase), en replikativ/S-fase, en G2 (anden hulfase) og en M-fase (mitotisk) fase. Passerer gennem disse faser, cellen gennemgår dramatiske ændringer i cellulære transskription, oversættelse, og re-organisation af cytoskeletal maskiner1,2. Som reaktion på udviklings- og miljømæssige signaler kan cellerne midlertidigt ophøre med at opdele og blive hvilende (G0) eller differentiere og permanent ophøre med at opdele3. Andre scenarier, såsom DNA-skader, kan forårsage for tidlig differentiering eller apoptose3,4. Reaktion på sådanne signaler medieres af cellecykluskontrolpunkter, der fungerer som et overvågningssystem for at sikre integriteten af vigtige cellulære processer, før cellen forpligter sig til næste fase afdivisionscyklussen 5. Derfor, undersøgelser af gener, der regulerer DNA-replikation, checkpoints, og mitotiske maskiner nødt til at analysere mulige celle cyklus progression defekter, der kan forekomme i mutantceller eller på siRNA knockdown af disse gener. Derudover kan sådanne analyser anvendes til at teste den samlede celle sundhed samt cellulære reaktioner på narkotikabehandling.
5-bromo-2′-deoxyuridin (BrdU) er en thymidin analog, der er indarbejdet i DNA under replikation6. Denne metode blev brugt i vid udstrækning til at identificere celler i S-fase. Cellerne udsættes dog derefter for barske DNA-denatureringsprocedurer for at muliggøre påvisning af BrdU ved hjælp af anti-BrdU antistoffer6. Denne barske behandling kan beskadige cellulære epitoper og forhindre yderligere karakterisering af prøven gennem immunstaining. EdU inkorporering og efterfølgende påvisning af en kobber-katalyseret, ‘klikreaktion’ med små, celle-gennemtrængelige, fluorescerende mærkede azid farvestoffer eliminerer behovet for barske denaturering procedurer7. Denne metode viste sig derfor at være et mere praktisk alternativ til BrdU-inkorporering.
Endvidere er pH3 blevet beskrevet som en pålidelig markør for mitotiske/M faseceller8. Histone H3 er en DNA-associeret kerne histone protein, der bliver fosforyleret i omkring den sene G2 fase til begyndelsen af M fase og er af-fosforyleret mod slutningen af anaphase8. Flere kommercielle antistoffer kan bruges til at opdage pH3 ved hjælp af standard immunstaining protokoller. Dobbeltfarvning af EdU og pH3 vil derfor gøre det muligt at detektere celler i S-fase såvel som M-fase. Derudover ville celler i G1 og begyndelsen af G2 fase ikke plette positivt for nogen af markører.
Drosophila neurale stamceller eller neuroblaster (NBs) tilbyder en velkarakteriseret stamcellemodel, hvori celler deler asymmetrisk for at producere en identisk selvfornyende NB og en ganglion modercelle (GMC), som er skæbnebestemt til differentiering9. Derudover, flere genetiske værktøjer og NB-specifikke antistoffer gør dette system egnet til genetisk manipulation og levende celle billeddannelse. Derfor har flere undersøgelser brugt NBs til at studere gener, der regulerer asymmetriske divisioner og celle skæbne bestemmelse9. Der findes forskellige populationer af NBs i den centrale hjerne (CB) og den optiske lap (OL) i larvehjernen9; CB NBs blev anvendt til den aktuelle undersøgelse. Disse tredje instar larval CB NBs er store celler, der også er egnede til at studere faktorer, der regulerer mitotisk spindel samling. En protokol til at analysere cellecyklus progression defekter ville være et vigtigt redskab i sådanne undersøgelser.
Protokoller offentliggjort tidligere ansat kommercielle kits, såsom Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, som giver flere reaktion komponenter og jad farvestoffer mærket med en række Alexa Fluor farvestoffer til EDU inkorporering og detektion10. De reagenser, der leveres med sådanne kits, er dog ikke kompatible med nogle fluorescerende tags, der ofte bruges med sekundære antistoffer. Denne EdU detektion kit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit leveres med Alexa Fluor 647-konjugeret azide farvestof) blev testet i Drosophila tredje instar larval NBs, og co-farvning blev forsøgt med antistoffer mod pH3 og Miranda, en markør for NBs. Yderligere, Alexa Fluor 568- eller Cy3-tagged sekundære antistoffer blev brugt til påvisning af Miranda mærkning på plasmamembranen af NBs11. Den forventede signalintensitet og farvningsmønster (ikke-offentliggjorte resultater) blev imidlertid ikke observeret med disse sekundære antistoffer, når immunstaining blev udført efter EdU-påvisning.
For EdU inkorporering krævede protokollen beskrevet af Daul og kolleger fodring af larverne med Kankel-White medium blandet med EdU og bromophenolblå (BPB)10. Larverne fodret på EdU og BPB-spiked mad, som kunne ses af sin blå farve ved indtagelse i larve tarm. Selv om denne metode blev brugt til EDU inkorporering i Mms19 tab af funktion (Mms19P) tredje instar larver, mms19P larver tilsyneladende ikke foder som næsten ingen blå farve blev opdaget i larve tarm (ikke-offentliggjorte resultater). Mms19P larverne viser drastiske udviklingsmæssige deformiteter og i sidste ende anholde i den tredje instar fase. Dette kan på en eller anden måde påvirke fodringsadfærden hos de tredje instar larver og gøre EdU-fodringsprotokollen uegnet til sådanne tilfælde.
Efter at have studeret den tilgængelige litteratur og arbejdet indgående med standardiseringen af væsentlige trin blev der foreslået en alternativ tilgang til EdU/pH3 dual-labeling i Drosophila NBs, som ikke kræver fodring af EdU til larver. En tidligere undersøgelse anvendte dobbelt EdU/pH3 farvning til at analysere cellecyklussen i NBs, men fremlagde ikke en detaljeret protokol4. Dette udgør en unødvendig forhindring for laboratorier forsøger at gennemføre denne metode. Desuden kan evaluering af kompatibiliteten af forskellige reagenser med EdU-sættet og udførelse af yderligere optimering være en tidskrævende proces. Dette papir præsenterer en trin-for-trin protokol, der dækker EDU inkorporering i dissekerede larvehjerner og immunstaining med anti-pH3 antistoffer, efterfulgt af konfokal mikroskopi og billedanalyse for at tildele NBs til fire forskellige kategorier: G0 / G1 fase, S fase, S>G2 / M (progression fra S til G2 / M), og M fase. De trin, der skal optimeres, er skitseret, og tip til billedanalyse af store datasæt. Derudover analyseres EdU/pH3-udlæsningen i wild-type NBs og sammenlignes med Mms19P NBs, som for nylig blev rapporteret til at vise en cellecyklusforsinkelse11.
Protocol
Representative Results
Discussion
EdU inkorporering og dens efterfølgende ‘klik’ reaktion med celle-permeable azide præsenterer praktiske fordele ved denne teknik i forhold til BrdU metode, der anvendes tidligere7. Denne reaktion er dog katalyseret af Cu (I) ioner, og flere farvestoffer kan være ustabile i nærværelse af denne kobberkatalysator, som det klart anbefales af Click-it EdU-kitproducenten. Når immunstaining eksperimenter var blevet udført efter udførelse af EdU detektion trin, den forventede signalintensitet blev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af midler fra Swiss National Science Foundation (projekttilskud 31003A_173188; www.snf.ch) og Universitetet i Bern (www.unibe.ch) til BS. Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberede manuskriptet.
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
