Protocole de double marquage 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 pour l’analyse de la progression du cycle cellulaire dans les cellules souches neurales de la drosophile

Summary

L’analyse du cycle cellulaire avec marquage de la 5-éthyhyyl-2′-désoxyuridine (EdU) et de la phospho-histone H3 (pH3) est une procédure en plusieurs étapes qui peut nécessiter une optimisation approfondie. Ici, nous présentons un protocole détaillé qui décrit toutes les étapes de cette procédure, y compris l’analyse d’images et la quantification pour distinguer les cellules dans différentes phases du cycle cellulaire.

Abstract

L’analyse in vivo de la progression du cycle cellulaire est régulièrement effectuée dans des études sur les gènes régulant la mitose et la réplication de l’ADN. La 5-éthyynyl-2′-désoxyuridine (EdU) a été utilisée pour étudier la progression réplicative/phase S, tandis que les anticorps dirigés contre la phospho-histone H3 ont été utilisés pour marquer les noyaux et les cellules mitotiques. Une combinaison des deux étiquettes permettrait de classer les phases G0/G1 (phase gap), S (réplicative) et M (mitotique) et constituerait un outil important pour évaluer les effets des knockdowns de gènes mitotiques ou des mutants nuls sur la progression du cycle cellulaire. Cependant, les réactifs utilisés pour marquer les cellules marquées EdU sont incompatibles avec plusieurs étiquettes fluorescentes d’anticorps secondaires. Cela complique l’immunocoloration, où des anticorps primaires et secondaires marqués sont utilisés pour marquer les cellules mitotiques pH3 positives. Cet article décrit un protocole étape par étape pour le double marquage de l’EdU et du pH3 dans les cellules souches neurales larvaires de la drosophile, un système largement utilisé pour étudier les facteurs mitotiques. De plus, un protocole est fourni pour l’analyse et la quantification des images afin d’allouer les cellules marquées en 3 catégories distinctes, G0/G1, S>G2/M (progression de S à G2/M) et M phases M.

Introduction

Le cycle de division cellulaire comprend une phase G1 (phase de premier intervalle), une phase réplicative/S, une phase G2 (deuxième phase d’intervalle) et une phase M (mitotique). En passant par ces phases, la cellule subit des changements spectaculaires dans la transcription cellulaire, la traduction et la réorganisation de la machinerie du cytosquelette^1,2. En réponse à des signaux développementaux et environnementaux, les cellules peuvent temporairement cesser de se diviser et devenir quiescentes (G0) ou se différencier et cesser définitivement de se diviser³. D’autres scénarios, tels que les dommages à l’ADN, peuvent provoquer une différenciation prématurée ou une apoptose^3,4. La réponse à ces signaux est médiée par des points de contrôle du cycle cellulaire, qui agissent comme un système de surveillance pour assurer l’intégrité des processus cellulaires essentiels avant que la cellule ne s’engage dans la phase suivante du cycle de division⁵. Par conséquent, les études sur les gènes régulant la réplication de l’ADN, les points de contrôle et la machinerie mitotique doivent analyser les éventuels défauts de progression du cycle cellulaire qui peuvent se produire dans les cellules mutantes ou lors de la destruction de ces gènes par siRNA. De plus, de telles analyses peuvent être utilisées pour tester la santé cellulaire globale ainsi que les réponses cellulaires au traitement médicamenteux.

La 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU) est un analogue de la thymidine qui est incorporé dans l’ADN lors de la réplication^6. Cette méthode a été largement utilisée pour identifier les cellules en phase S. Cependant, les cellules sont ensuite soumises à des procédures de dénaturation de l’ADN sévères pour permettre la détection de BrdU grâce à l’utilisation d’anticorps anti-BrdU^6. Ce traitement sévère peut endommager les épitopes cellulaires et empêcher une caractérisation plus poussée de l’échantillon par immunocoloration. L’incorporation d’EdU et la détection ultérieure par une « réaction de clic » catalysée par le cuivre avec de petits colorants azotés perméables aux cellules et marqués par fluorescence éliminent le besoin de procédures de dénaturation sévères⁷. Cette méthode est donc apparue comme une alternative plus pratique à l’incorporation BrdU.

De plus, le pH3 a été décrit comme un marqueur fiable pour les cellules de phase mitotique/M^8. L’histone H3 est une protéine histone centrale associée à l’ADN qui devient phosphorylée vers la fin de la phase G2 à la phase M précoce et est déphospholylée vers la fin de l’anaphase^8. Plusieurs anticorps commerciaux peuvent être utilisés pour détecter le pH3 à l’aide de protocoles d’immunocoloration standard. La double coloration de l’EdU et du pH3 permettrait donc de détecter les cellules en phase S ainsi qu’en phase M. De plus, les cellules de la phase G1 et du début de la phase G2 ne tacheraient pas positivement pour l’un ou l’autre des marqueurs.

Les cellules souches neurales (NB) de la drosophile offrent un modèle de cellules souches bien caractérisé dans lequel les cellules se divisent de manière asymétrique pour produire un NB auto-renouvelant identique et une cellule mère ganglionnaire (GMC), qui est destinée à la différenciation⁹. De plus, plusieurs outils génétiques et anticorps spécifiques au NB rendent ce système adapté à la manipulation génétique et à l’imagerie des cellules vivantes. Par conséquent, plusieurs études ont utilisé des NB pour étudier les gènes régulant les divisions asymétriques et la détermination du devenir cellulaire⁹. Des populations distinctes de NB existent dans le cerveau central (CB) et le lobe optique (OL) du cerveau larvaire⁹; Des CB NB ont été utilisés pour la présente étude. Ces CB larvaires du troisième stade sont de grandes cellules qui conviennent également à l’étude des facteurs régulant l’assemblage du fuseau mitotique. Un protocole pour analyser les défauts de progression du cycle cellulaire serait un outil essentiel dans de telles études.

Les protocoles publiés précédemment utilisaient des kits commerciaux, tels que Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, qui fournissent plusieurs composants de réaction et colorants azides marqués avec une variété de colorants Alexa Fluor pour l’incorporation et la détection EdU¹⁰. Cependant, les réactifs fournis avec de tels kits ne sont pas compatibles avec certaines étiquettes fluorescentes souvent utilisées avec des anticorps secondaires. Ce kit de détection EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit fourni avec le colorant azide conjugué Alexa Fluor 647) a été testé chez les NB larvaires de la troisième étoile de la drosophile, et la co-coloration a été tentée avec des anticorps contre le pH3 et Miranda, un marqueur des NB. De plus, des anticorps secondaires marqués Alexa Fluor 568 ou Cy3 ont été utilisés pour la détection du marquage Miranda sur la membrane plasmique des NB^11. Cependant, l’intensité attendue du signal et le schéma de coloration (résultats non publiés) n’ont pas été observés avec ces anticorps secondaires lorsque l’immunocoloration a été effectuée après la détection de l’EdU.

Pour l’incorporation d’EdU, le protocole décrit par Daul et ses collègues nécessitait l’alimentation des larves avec un milieu Kankel-White mélangé à de l’EdU et du bleu de bromophénol (BPB)^10. Les larves se nourrissaient de nourriture enrichie en EdU et en BPB, ce qui pouvait être vu par sa couleur bleue lors de l’ingestion dans l’intestin larvaire. Bien que cette méthode ait été utilisée pour l’incorporation d’EdU dans mms19 de perte de fonction(Mms19^P)des larves du troisième stade, les larves de Mms19^P ne se sont apparemment pas nourries car pratiquement aucune couleur bleue n’a été détectée dans l’intestin larvaire (résultats non publiés). Les larves de Mms19^P présentent des déformations de développement drastiques et finissent par s’arrêter au stade du troisième stade. Cela peut en quelque sorte affecter le comportement alimentaire des larves du troisième stade et rendre le protocole d’alimentation EdU inadapté à de tels cas.

Après avoir étudié la littérature disponible et travaillé de manière approfondie sur la normalisation des étapes essentielles, une approche alternative a été proposée pour le double marquage EdU/pH3 chez les NB de drosophiles, qui ne nécessite pas d’alimentation des larves avec de l’EdU. Une étude précédente utilisait une double coloration EdU/pH3 pour analyser le cycle cellulaire dans les NB, mais n’a pas présenté de protocole détaillé^4. Cela représente un obstacle inutile pour les laboratoires qui tentent de mettre en œuvre cette méthode. En outre, l’évaluation de la compatibilité de divers réactifs avec le kit EdU et l’optimisation ultérieure peuvent prendre beaucoup de temps. Cet article présente un protocole étape par étape qui couvre l’incorporation d’EdU dans les cerveaux larvaires disséqués et l’immunocoloration avec des anticorps anti-pH3, suivie de la microscopie confocale et de l’analyse d’images pour attribuer les NB à quatre catégories distinctes: phase G0 / G1, phase S, S>G2 / M (progression de S à G2 / M) et phase M. Les étapes à optimiser sont décrites et des conseils sont fournis pour l’analyse d’images de grands ensembles de données. De plus, la lecture EdU/pH3 dans les NB de type sauvage est analysée et comparée aux NB Mms19^P, qui ont récemment montré un retard du cycle cellulaire¹¹.

Protocol

1. Préparation des réactifs et des stocks pour le test Click-it EdU REMARQUE : Reportez-vous au tableau des matériaux et au tableau 1 pour plus de détails sur le kit et les réactifs fournis avec le kit. Porter les flacons à température ambiante avant de préparer les solutions. Préparer une solution mère d’EdU (composant A) de 10 mM en ajoutant 2 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO, composant C). Bien mélanger et conserver à -20 °C…

Representative Results

Le cerveau larvaire bi-lobé de la drosophile troisième stade a été utilisé comme système modèle pour étudier les processus cellulaires et de développement fondamentaux9. L’objectif de la présente étude était de présenter un protocole d’analyse de la progression du cycle cellulaire dans les NB marqués EdU et pH3 de la région CB (Figure 1). Les CB NB sont subdivisés en type I et type II, et ils présentent le modèle de division asymétrique…

Discussion

L’incorporation d’EdU et sa réaction de « clic » subséquente avec de l’azoture perméable aux cellules présentent les avantages pratiques de cette technique par rapport à la méthode BrdU utilisée précédemment^7. Cependant, cette réaction est catalysée par les ions Cu(I), et plusieurs colorants peuvent être instables en présence de ce catalyseur en cuivre, comme le conseille clairement le fabricant du kit Click-it EdU. Lorsque des expériences d’immunocoloration ont été effec…

Materials

fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	P-element insertion in the third exon of Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Generated in house		eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118	Bloomington stock center	#3605	wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies			Dilution
Rat anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Rabbit anti-pH3	Cell Signaling	9701	1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider’s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph pad software	Version 5
Microsoft Excel	Microsoft office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium			water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper