5-Ethynyl-2'-Desoxyuridine/Phospho-Histone H3 Protocolo de rotulagem dupla para análise de progressão do ciclo celular em células-tronco neurais Drosophila
Summary
A análise do ciclo celular com 5-ethynyl-2′-desoxyuridina (EdU) e rotulagem phospho-histone H3 (pH3) é um procedimento de várias etapas que pode exigir uma otimização extensiva. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que descreve todas as etapas para este procedimento, incluindo análise de imagens e quantificação para distinguir células em diferentes fases do ciclo celular.
Abstract
A análise de progressão do ciclo in vivo é realizada rotineiramente em estudos sobre genes que regulam mitose e replicação de DNA. 5-Ethynyl-2′-desoxyuridina (EdU) foi utilizado para investigar a progressão replicativa/fase S, enquanto anticorpos contra fosfo-histona H3 foram utilizados para marcar núcleos e células mitóticas. Uma combinação de ambos os rótulos permitiria a classificação das fases G0/G1 (Fase gap), S (replicativa) e M (mitostítico) e serviria como uma ferramenta importante para avaliar os efeitos de knockdowns de genes mitotísticos ou mutantes nulos na progressão do ciclo celular. No entanto, os reagentes usados para marcar células rotuladas pela EdU são incompatíveis com várias etiquetas secundárias de anticorpos fluorescentes. Isso complica a imunostaining, onde anticorpos secundários primários e marcados são usados para marcar células mitóticas pH3 positivas. Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo para a rotulagem dupla de EdU e pH3 em células-tronco neurais larval Drosophila, um sistema utilizado extensivamente para estudar fatores mitóticos. Além disso, é fornecido um protocolo para análise de imagem e quantificação para alocar células rotuladas em 3 categorias distintas, G0/G1, S, S>G2/M (progressão de S para G2/M) e M.
Introduction
O ciclo de divisão celular compreende uma fase G1 (primeira fase de lacuna), uma fase replicativa/S, um G2 (segunda fase de lacuna) e uma fase M (mitótica). Passando por essas fases, a célula sofre mudanças drásticas na transcrição celular, tradução e reorganização das máquinas citoesquelletais1,2. Em resposta às sugestões de desenvolvimento e meio ambiente, as células podem deixar temporariamente de dividir e tornar-se quiescentes (G0) ou diferenciar e parar permanentemente de dividir3. Outros cenários, como danos ao DNA, podem causar diferenciação prematura ou apoptose3,4. A resposta a tais pistas é mediada por pontos de verificação de ciclo celular, que atuam como um sistema de vigilância para garantir a integridade dos processos celulares essenciais antes que a célula se comprometa com a próxima fase do ciclo de divisão5. Portanto, estudos sobre genes que regulam a replicação do DNA, pontos de verificação e máquinas mitóticas precisam analisar possíveis defeitos de progressão do ciclo celular que podem ocorrer em células mutantes ou no knockdown do siRNA desses genes. Além disso, tais análises podem ser empregadas para testar a saúde geral das células, bem como as respostas celulares ao tratamento medicamentoso.
5-bromo-2′-desoxyuridina (BrdU) é um analógico de timmidina que é incorporado ao DNA durante a replicação6. Este método foi utilizado extensivamente para identificar células em fase S. No entanto, as células são então submetidas a procedimentos severos de desnaturação de DNA para permitir a detecção de BrdU através do uso de anticorpos anti-BrdU6. Este tratamento severo pode danificar epítopos celulares e evitar uma caracterização adicional da amostra através da imunostainagem. A incorporação da EdU e a posterior detecção por uma “reação de clique” catalisada por cobre com corantes de azide pequenos, permeáveis e fluorescentes elimina a necessidade de procedimentos de desnaturação severos7. Esse método, portanto, emergiu como uma alternativa mais prática à incorporação da BrdU.
Além disso, o pH3 tem sido descrito como um marcador confiável para células de fase mitótica/M8. Histone H3 é uma proteína histona de núcleo associada ao DNA que se torna fosfoilada em torno da fase G2 tardia até a fase M inicial e é desfosforilada no final da anáfase8. Vários anticorpos comerciais podem ser usados para detectar pH3 usando protocolos padrão de imunossuagem. A coloração dupla de EdU e pH3 permitiria, portanto, a detecção de células em fase S, bem como em fase M. Além disso, as células do G1 e início da fase G2 não manchariam positivamente nenhum dos marcadores.
As células-tronco neurais drosophila ou neuroblastos (NBs) oferecem um modelo de células-tronco bem caracterizados onde as células se dividem assimetricamente para produzir um NB auto-renovador idêntico e uma célula-mãe de gânglio (GMC), que é fadada à diferenciação9. Além disso, várias ferramentas genéticas e anticorpos específicos do RN tornam este sistema adequado para manipulação genética e imagens de células vivas. Consequentemente, vários estudos utilizaram NBs para estudar genes que regulam divisões assimétricas e determinação do destino celular9. Populações distintas de NBs existem no cérebro central (CB) e no lobo óptico (OL) do cérebro larval9; Foram utilizados NBs cb para o presente estudo. Estas terceiras NBs cb larval instar são células grandes que também são adequadas para estudar fatores que regulam a montagem de fuso mitótico. Um protocolo para analisar defeitos de progressão do ciclo celular seria uma ferramenta vital em tais estudos.
Protocolos publicados anteriormente empregavam kits comerciais, como o Kit de Proliferação celular Click-iT EdU Alexa Fluor, que fornecem vários componentes de reação e corantes de azida marcados com uma variedade de corantes Alexa Fluor para incorporação e detecçãoedu 10. No entanto, os reagentes fornecidos com tais kits não são compatíveis com algumas etiquetas fluorescentes frequentemente usadas com anticorpos secundários. Este kit de detecção de células EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit fornecido com corante de azide alexa fluor 647) foi testado em Drosophila terceiro NBs larval instar, e co-coloração foi tentado com anticorpos contra pH3 e Miranda, um marcador para NBs. Além disso, foram utilizados anticorpos secundários alexa Fluor 568 ou Cy3 para detecção da rotulagem de Miranda na membrana plasmática de NBs11. No entanto, a intensidade esperada do sinal e o padrão de coloração (resultados inéditos) não foram observados com esses anticorpos secundários quando a imunossagem foi realizada após a detecção da EdU.
Para a incorporação da EdU, o protocolo descrito por Daul e colegas exigia alimentação das larvas com meio Kankel-Branco misturado com EdU e azul bromofenol (BPB)10. As larvas se alimentavam do alimento EdU e bpb-spiked, que podiam ser vistos por sua cor azul após a ingestão no intestino larval. Embora este método tenha sido utilizado para a incorporação da EdU em Mms19 loss-of-function(Mms19P) terceira larva instar, as larvas Mms19P aparentemente não se alimentaram, pois quase nenhuma cor azul foi detectada no intestino larval (resultados inéditos). As larvas mms19P mostram drásticas deformidades de desenvolvimento e eventualmente prendem na terceira fase instar. Isso pode de alguma forma afetar o comportamento alimentar da terceira larva instar e tornar o protocolo de alimentação da EdU inadequado para esses casos.
Após estudar a literatura disponível e trabalhar extensivamente na padronização de etapas essenciais, foi proposta uma abordagem alternativa para a rotulagem dupla EdU/pH3 em NBs Drosophila, o que não requer alimentação de EdU para larvas. Um estudo anterior utilizou coloração dupla de EdU/pH3 para analisar o ciclo celular em NBs, mas não apresentou um protocolo detalhado4. Isso representa um obstáculo desnecessário para os laboratórios que tentam implementar esse método. Além disso, avaliar a compatibilidade de vários reagentes com o kit EdU e realizar uma maior otimização pode ser um processo demorado. Este artigo apresenta um protocolo passo-a-passo que abrange a incorporação da EdU em cérebros larvais dissecados e imunostaining com anticorpos anti-pH3, seguido de microscopia confocal e análise de imagem para alocar NBs para quatro categorias distintas: fase G0/G1, fase S, S>G2/M (progressão de S para G2/M) e fase M. As etapas que precisam de otimização são delineadas e dicas fornecidas para análise de imagens de grandes conjuntos de dados. Além disso, a leitura de EdU/pH3 em NBs do tipo selvagem é analisada e comparada com os NBs Mms19P, que foram recentemente relatados para mostrar um atraso no ciclocelular 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
A incorporação da EdU e sua reação subsequente de “clique” com azida permeável celular apresenta vantagens práticas desta técnica sobre o método BrdU utilizado anteriormente7. No entanto, essa reação é catalisada por íons Cu(I), e vários corantes podem ser instáveis na presença deste catalisador de cobre, como é claramente aconselhado pelo fabricante do kit Click-it EdU. Quando os experimentos de imunosstaining foram realizados após a execução da etapa de detecção da EdU, a in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por financiamento da Fundação Nacional de Ciência suíça (concessão de projetos 31003A_173188; www.snf.ch) e da Universidade de Berna (www.unibe.ch) para a BS. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
