5-Ethynyl-2'-Desoxyuridine/Phospho-Histone H3 Protocolo de rotulagem dupla para análise de progressão do ciclo celular em células-tronco neurais Drosophila

Resumo

A análise do ciclo celular com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) e rotulagem phospho-histone H3 (pH3) é um procedimento de várias etapas que pode exigir uma otimização extensiva. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que descreve todas as etapas para este procedimento, incluindo análise de imagens e quantificação para distinguir células em diferentes fases do ciclo celular.

Resumo

A análise de progressão do ciclo in vivo é realizada rotineiramente em estudos sobre genes que regulam mitose e replicação de DNA. 5-Ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) foi utilizado para investigar a progressão replicativa/fase S, enquanto anticorpos contra fosfo-histona H3 foram utilizados para marcar núcleos e células mitóticas. Uma combinação de ambos os rótulos permitiria a classificação das fases G0/G1 (Fase gap), S (replicativa) e M (mitostítico) e serviria como uma ferramenta importante para avaliar os efeitos de knockdowns de genes mitotísticos ou mutantes nulos na progressão do ciclo celular. No entanto, os reagentes usados para marcar células rotuladas pela EdU são incompatíveis com várias etiquetas secundárias de anticorpos fluorescentes. Isso complica a imunostaining, onde anticorpos secundários primários e marcados são usados para marcar células mitóticas pH3 positivas. Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo para a rotulagem dupla de EdU e pH3 em células-tronco neurais larval Drosophila, um sistema utilizado extensivamente para estudar fatores mitóticos. Além disso, é fornecido um protocolo para análise de imagem e quantificação para alocar células rotuladas em 3 categorias distintas, G0/G1, S, S>G2/M (progressão de S para G2/M) e M.

Introdução

O ciclo de divisão celular compreende uma fase G1 (primeira fase de lacuna), uma fase replicativa/S, um G2 (segunda fase de lacuna) e uma fase M (mitótica). Passando por essas fases, a célula sofre mudanças drásticas na transcrição celular, tradução e reorganização das máquinas citoesquelletais^1,2. Em resposta às sugestões de desenvolvimento e meio ambiente, as células podem deixar temporariamente de dividir e tornar-se quiescentes (G0) ou diferenciar e parar permanentemente de dividir³. Outros cenários, como danos ao DNA, podem causar diferenciação prematura ou apoptose

Protocolo

1. Preparação de reagentes e estoques para ensaio click-it EdU

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais e a Tabela 1 para obter detalhes sobre o kit e os reagentes fornecidos com o kit.

1. Leve os frascos à temperatura ambiente antes de preparar as soluções.
2. Prepare a solução de estoque EdU de 10 mM (componente A) adicionando 2 mL de dimetilsulfoxida (DMSO, componente C). Misture bem e armazene a -20 °C.
3. Prepare uma solução de trabalho do Alexa Fluor 647-azide (componente B) adicionando 70μL de DMSO (componente C). Misture bem e armazene a -20 °C.
4. Prepare uma solução 1x de c....

Resultados

O terceiro cérebro larval de Drosophila bi-lobed tem sido utilizado como um sistema modelo para estudar processos celulares e de desenvolvimento fundamentais⁹. O foco do presente estudo foi apresentar um protocolo para análise da progressão do ciclo celular em NBs EdU e pH3 da região do CB (Figura 1). Os NBs CB são subdivididos em tipo I e tipo II, e exibem o padrão característico de divisão assimétrica⁹. Cada divisão tipo I NB gera um.......

Discussão

A incorporação da EdU e sua reação subsequente de "clique" com azida permeável celular apresenta vantagens práticas desta técnica sobre o método BrdU utilizado anteriormente⁷. No entanto, essa reação é catalisada por íons Cu(I), e vários corantes podem ser instáveis na presença deste catalisador de cobre, como é claramente aconselhado pelo fabricante do kit Click-it EdU. Quando os experimentos de imunosstaining foram realizados após a execução da etapa de detecção da EdU, a intensidade esperada do.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	Inserção do elemento P no terceiro exon de Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Proteína	Mms19 marcada com eGFP
w1118	Bloomington stock center	#3605	estoque de tipo selvagem (w;+;+)
Anticorpos			Diluição
Rato anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Coelho anti-pH3	Sinalização celular	9701	1/200
Anticorpos secundários
Cabra anti-Rato Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Cabra anti-Rato Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Cabra anti-Coelho Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagente/Kit
Aqua Poly/Mount mount medium	Polysciences Inc	18606-20
Kit de incorporação Click-it EdU, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider' s Meio Drosophila	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Albumina de soro bovino (BSA) fração V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	detergente não iônico
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Software Leica microsystems
PRISM	Graph pad	Versão 5
Microsoft Excel	Microsoft Office	2016
Equipment
Microscópio confocal de varredura a laser Leica TCS SP8 com imersão em óleo de 63x, objetiva
Materiais
Aqua Poly/Meio			de montagem solúvel em água, meio de montagem não fluorescente
Pyrex 3 ou 9 depressão placa de vidro
de filtro

expressa em fundo Mms19p primários apocromática plana de 1,4 NA de montagem Papel Whatman