Drosophila 신경 줄기 세포에서 세포 주기 진행 분석을 위한 5-에티닐-2'-Deoxyuridine/인성-히스톤 H3 이중 라벨링 프로토콜
Summary
5-에티닐-2′-데옥시리딘(EdU) 및 인산히스톤 H3(pH3) 라벨링을 함유한 세포 주기 분석은 광범위한 최적화를 요구할 수 있는 다단계 절차이다. 여기서는 상이한 세포 주기 단계에서 세포를 구별하기 위해 이미지 분석 및 정량화를 포함한 이 절차에 대한 모든 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
생체 내 세포 주기 진행 분석은 미토시스 및 DNA 복제를 조절하는 유전자에 대한 연구에서 일상적으로 수행됩니다. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)는 복제 /S 상 진행을 조사하기 위해 활용된 반면 인 – 히스톤 H3에 대한 항체는 미토틱 핵및 세포를 표시하는 데 활용되었습니다. 두 라벨의 조합은 G0/G1(갭 상), S(복제), M(미토틱) 단계의 분류를 가능하게 하고 세포 주기 진행에 미토성 유전자 녹다운 또는 null 돌연변이체의 효과를 평가하는 중요한 도구로 작용합니다. 그러나, EdU 라벨이 부착된 세포를 표시하는 데 사용되는 시약은 여러 이차 항체 형광 태그와 호환되지 않습니다. 이것은 pH3 양성 미토아 세포를 표시하기 위하여 1 차적이고 태그된 이차 항체가 이용되는 면역 염색을 복잡하게 합니다. 이 논문은 드로소필라 애벌레 신경 줄기 세포에서 EdU와 pH3의 이중 라벨링을 위한 단계별 프로토콜을 설명하며, 이는 미토Tic 요인을 연구하기 위해 광범위하게 활용된 시스템입니다. 또한, 이미지 분석 및 정량화를 위해 3개의 별개의 범주, G0/G1, S, S>G2/M(S에서 G2/M로진행) 및 M 상에 표지된 셀을 할당하기 위한 프로토콜이 제공됩니다.
Introduction
상기 세포 분열 주기는 G1 상(제1 갭상), 복제/S-phase, G2(제2 갭 상), 및 M(미토틱) 위상을 포함한다. 이러한 단계를 통과하면 세포는 세포 전사, 번역 및 세포 켈레탈기계1,2의재구성에 극적인 변화를 겪습니다. 발달 및 환경 단서에 응하여, 세포는 일시적으로 분할을 중단하고 정지(G0)가 되거나 분화하고 영구적으로3를분할하는 것을 중단할 수 있다. DNA 손상과 같은 다른 시나리오는 조기 분화 또는세포멸을일으킬 수 있습니다3,4. 이러한 단서에 대한 반응은 세포 주기 검사점에 의해 중재되며, 이는 세포가 분할 주기5의다음 단계에 커밋하기 전에 필수 세포 프로세스의 무결성을 보장하기 위해 감시 시스템역할을 한다. 따라서 DNA 복제, 검사점 및 미토틱 기계를 조절하는 유전자에 대한 연구는 돌연변이 세포 또는 이러한 유전자의 siRNA 녹다운 시 발생할 수 있는 가능한 세포 주기 진행 결함을 분석해야 합니다. 추가적으로, 그 같은 분석은 약물 치료에 대한 세포 반응뿐만 아니라 전반적인 세포 건강을 테스트하기 위해 사용될 수있다.
5-브로모-2′-데옥시리딘(BrdU)은 복제6동안 DNA에 통합되는 티미딘 아날로그이다. 이 방법은 S-phase에서 세포를 식별하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 그러나, 세포는 그 때 반대로 BrdU 항체 6의 사용을 통해 BrdU의 검출을 허용하기 위하여 가혹한 DNA 변성 절차를 복종한다6. 이 가혹한 처리는 세포 전형을 손상하고 면역 염색을 통해 견본의 추가 특성화를 방지할 수 있습니다. EdU 는 구리 촉매에 의한 후속 검출, 작은 세포 투과성, 형광 태그 아지드 염료로 ‘클릭 반응’은 가혹한 변성 절차7의필요성을 제거합니다. 따라서 이 방법은 BrdU 통합에 대한 보다 실용적인 대안으로 부상했습니다.
또한, pH3는 미토틱/M상세포(8)에대한 신뢰할 수 있는 마커로 기재되었다. 히스톤 H3는 후기 G2 상에서 초기 M 상으로 인광되는 DNA 관련 코어 히스톤 단백질로, 아나상8의끝을 향해 탈인된다. 몇몇 상업적인 항체는 표준 면역 염색 프로토콜을 사용하여 pH3를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다. 따라서 EdU 및 pH3의 이중 염색은 M-phase뿐만 아니라 S 상에서 세포의 검출을 가능하게 합니다. 추가적으로, G1 및 초기 G2 상에 있는 세포는 마커의 둘 다에 대해 긍정적으로 얼룩지지 않을 것입니다.
Drosophila 신경 줄기 세포 또는 신경 폭발 (NBs)는 세포가 비대칭적으로 분할하여 1 개의 동일한 자기 갱신 NB및 신경절 모세포 (GMC)를 생성하는 잘 특징적인 줄기 세포 모델을 제공하며, 이는 분화9에대해 지방이 된다. 추가적으로, 몇몇 유전 공구 및 NB 특정 항체는 유전 조작 및 살아있는 세포 화상 진찰에 적합한 이 시스템을 만듭니다. 따라서, 몇몇 연구 결과는 비대칭 분열 및 세포 운명 결정결정 9를통제하는 유전자를 연구하기 위하여 NB를 이용했습니다. NB의 뚜렷한 인구는 중앙 뇌 (CB) 및 애벌레 뇌의 광학 엽 (OL)에존재9; CB NB는 현재 연구에 사용되었습니다. 이 세 번째 인스타 애벌레 CB NB는 또한 미토틱 스핀들 조립을 조절하는 요인을 연구하는 데 적합한 큰 세포입니다. 세포 주기 진행 결함을 분석 하는 프로토콜 이러한 연구에서 중요 한 도구가 될 것 이다.
이전에 발표된 프로토콜은 EdU 통합 및검출(10)에대한 다양한 알렉사 플루오르 염료로 태그된 여러 반응 성분및 아지드 염료를 제공하는 Click-iT EdU Alexa Fluor 세포 증식 키트와 같은 상용 키트를 이전에 사용했다. 그러나, 이러한 키트와 함께 공급되는 시약은 종종 이차 항체와 함께 사용되는 일부 형광 태그와 호환되지 않는다. 이 EdU 검출 키트(알렉사 플루어 647-컨쥬게이트 아지드 염료와 함께 제공된 Click-iT EdU Alexa Fluor 세포 증식 키트)는 드로소필라 제3 인스타 애벌레 NBs에서 테스트되었으며, NB의 마커인 pH3및 Miranda에 대한 항체로 공동 염색을 시도하였다. 또한, 알렉사 플루어(568) 또는 Cy3 태그이 부착된 이차 항체는NBs(11)의혈장 막에 미란다 라벨링의 검출을 위해 사용되었다. 그러나, 예상 신호 강도 및 염색 패턴(미공개 결과)은 EdU 검출 후 면역염색이 수행되었을 때 이러한 이차 항체와 함께 관찰되지 않았다.
EdU 통합의 경우, Daul과 동료가 설명한 프로토콜은 EdU 및 브로모페놀 블루(BPB)10과혼합된 칸켈-화이트 배지로 애벌레를 먹이야 하였다. 애벌레는 EdU와 BPB 가시 식품에 먹이를 주었는데, 이는 애벌레 창자에 섭취시 청색으로 보일 수 있습니다. 이 방법은 Mms19 기능 상실(Mms19P)세 번째 인스타 애벌레에 EdU 편입에 사용되었지만, Mms19P 유충은 분명히 유충 장에서 검출된 거의 모든 파란색으로 공급되지 않았다 (공개되지 않은 결과). Mms19P 애벌레는 과감한 발달 기형을 보여주고 결국 세 번째 인스타 단계에서 체포됩니다. 이것은 어떻게 든 세 번째 인스타 애벌레의 먹이 행동에 영향을 미치고 EdU 공급 프로토콜이 그러한 경우에 적합하지 않게 만들 수 있습니다.
사용 가능한 문헌을 연구하고 필수 단계의 표준화에 광범위하게 작업 한 후, 드로소필라 NBs에서 EdU / pH3 이중 라벨링에 대한 대체 접근 법을 제안했으며, 이는 EdU를 유충에 공급할 필요가 없습니다. 이전 연구는 NBs에서 세포 주기를 분석하기 위해 듀얼 EdU/pH3 염색을 사용했지만 상세한 프로토콜4를제시하지 않았다. 이렇게 하면 이 메서드를 구현하려는 랩에 불필요한 장애물이 있습니다. 또한 EdU 키트와의 다양한 시약과의 호환성을 평가하고 추가 최적화를 수행하는 것은 시간이 많이 소요되는 과정이 될 수 있습니다. 이 논문은 EdU가 항 pH3 항체를 사용하여 해부된 애벌레 뇌에 대한 EdU 편입 및 면역 염색을 포함하는 단계별 프로토콜을 제시하고, 공초점 현미경 검사법과 이미지 분석을 통해 NB를 G0/G1 단계, S단계, S>G2/M(S에서 G2/M로 진행) 및 M상에 할당합니다. 최적화가 필요한 단계는 설명되고 큰 데이터 집합의 이미지 분석을 위해 제공되는 팁이 설명되어 있습니다. 또한, 야생형 NB의 EdU/pH3 판독편은 Mms19P NB와 비교하여 분석되고 비교되며, 이는 최근 세포 주기지연(11)을나타내기 위해 보고된 것으로 보고되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
EdU 통합 및 세포 투과성 아지드와의 후속 ‘클릭’ 반응은 이전7에서사용된 BrdU 방법에 비해 이 기술의 실질적인 이점을 제시한다. 그러나, 이러한 반응은 Cu(I) 이온에 의해 촉매화되고, 여러 염료는 이 구리 촉매의 존재에서 불안정할 수 있으며, 이는 클릭-it EdU 키트 제조업체의 권고와 같이. EdU 검출 단계를 실행한 후 면역 염색 실험이 수행되었을 때, 예상 신호 강도는 적색 채널 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (프로젝트 보조금 31003A_173188; www.snf.ch)과 베른 대학 (www.unibe.ch)에서 BS에 자금을 지원했습니다. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 작성에 아무런 역할이 없었습니다.
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
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