Protocollo a doppia marcatura 5-etinil-2'-deossiuridina/fosfo-istone H3 per l'analisi della progressione del ciclo cellulare nelle cellule staminali neurali della drosofila
Summary
L’analisi del ciclo cellulare con etichettatura 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) e fosfo-istone H3 (pH3) è una procedura in più fasi che può richiedere un’ampia ottimizzazione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive tutti i passaggi per questa procedura, compresa l’analisi e la quantificazione delle immagini per distinguere le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare.
Abstract
L’analisi della progressione del ciclo cellulare in vivo viene eseguita di routine in studi sui geni che regolano la mitosi e la replicazione del DNA. La 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) è stata utilizzata per studiare la progressione replicativa / fase S, mentre gli anticorpi contro il fosfo-istone H3 sono stati utilizzati per marcare nuclei e cellule mitotiche. Una combinazione di entrambe le etichette consentirebbe la classificazione delle fasi G0/G1 (fase Gap), S (replicativa) e M (mitotica) e servirebbe come strumento importante per valutare gli effetti dei knockdown dei geni mitotici o dei mutanti nulli sulla progressione del ciclo cellulare. Tuttavia, i reagenti utilizzati per contrassegnare le cellule marcate con EdU sono incompatibili con diversi tag fluorescenti anticorpali secondari. Ciò complica l’immunocolorazione, in cui gli anticorpi primari e secondari marcati vengono utilizzati per contrassegnare le cellule mitotiche pH3-positive. Questo documento descrive un protocollo passo-passo per la doppia etichettatura di EdU e pH3 nelle cellule staminali neurali larvali di Drosophila, un sistema ampiamente utilizzato per studiare i fattori mitotici. Inoltre, viene fornito un protocollo per l’analisi e la quantificazione delle immagini per allocare le cellule etichettate in 3 categorie distinte, G0 / G1, S, S >G2 / M (progressione da S a G2 / M) e M fasi.
Introduction
Il ciclo di divisione cellulare comprende una fase G1 (prima fase gap), una fase replicativa/S, una G2 (seconda fase gap) e una fase M (mitotica). Passando attraverso queste fasi, la cellula subisce cambiamenti drammatici nella trascrizione cellulare, nella traduzione e nella riorganizzazione del macchinario citoscheletrico1,2. In risposta a segnali di sviluppo e ambientali, le cellule possono temporaneamente cessare di dividersi e diventare quiescenti (G0) o differenziarsi e cessare permanentemente di dividersi3. Altri scenari, come il danno al DNA, possono causare differenziazione prematura o apoptosi3,4. La risposta a tali segnali è mediata da checkpoint del ciclo cellulare, che fungono da sistema di sorveglianza per garantire l’integrità dei processi cellulari essenziali prima che la cellula si impegni nella fase successiva del ciclo di divisione5. Pertanto, gli studi sui geni che regolano la replicazione del DNA, i checkpoint e i macchinari mitotici devono analizzare possibili difetti di progressione del ciclo cellulare che possono verificarsi nelle cellule mutanti o dopo l’abbattimento del siRNA di questi geni. Inoltre, tali analisi possono essere utilizzate per testare la salute generale delle cellule e le risposte cellulari al trattamento farmacologico.
La 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU) è un analogo della timidina che viene incorporato nel DNA durante la replicazione6. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per identificare le cellule in fase S. Tuttavia, le cellule vengono poi sottoposte a dure procedure di denaturazione del DNA per consentire il rilevamento di BrdU attraverso l’uso di anticorpi anti-BrdU6. Questo duro trattamento può danneggiare gli epitopi cellulari e impedire un’ulteriore caratterizzazione del campione attraverso l’immunocolorazione. L’incorporazione di EdU e il successivo rilevamento da parte di una “reazione a clic” catalizzata dal rame con coloranti azide piccoli, permeabili alle cellule e marcati fluorescentemente, elimina la necessità di procedure di denaturazione severe7. Questo metodo, quindi, è emerso come un’alternativa più pratica all’incorporazione di BrdU.
Inoltre, pH3 è stato descritto come un marcatore affidabile per le cellule mitotiche/in fase M8. L’istone H3 è una proteina istonica del nucleo associata al DNA che viene fosforilata intorno alla fase G2 tardiva alla fase M iniziale e viene defosforilata verso la fine dell’anafase8. Diversi anticorpi commerciali possono essere utilizzati per rilevare il pH3 utilizzando protocolli di immunocolorazione standard. La doppia colorazione di EdU e pH3 consentirebbe quindi il rilevamento di cellule in fase S e in fase M. Inoltre, le cellule nella fase G1 e nella fase G2 iniziale non si macchierebbero positivamente per nessuno dei marcatori.
Le cellule staminali neurali o neuroblasti (NB) di Drosophila offrono un modello di cellule staminali ben caratterizzato in cui le cellule si dividono in modo asimmetrico per produrre un NB auto-rinnovante identico e una cellula madre gangliare (GMC), che è destinata alla differenziazione9. Inoltre, diversi strumenti genetici e anticorpi nb-specifici rendono questo sistema adatto per la manipolazione genetica e l’imaging di cellule vive. Di conseguenza, diversi studi hanno utilizzato NB per studiare i geni che regolano le divisioni asimmetriche e la determinazione del destino cellulare9. Popolazioni distinte di NB esistono nel cervello centrale (CB) e nel lobo ottico (OL) del cervello larvale9; Per il presente studio sono stati utilizzati CB NB. Questi CB NB larvali instar sono cellule di grandi dimensioni che sono adatte anche per studiare i fattori che regolano l’assemblaggio del fuso mitotico. Un protocollo per analizzare i difetti di progressione del ciclo cellulare sarebbe uno strumento vitale in tali studi.
I protocolli pubblicati in precedenza impiegavano kit commerciali, come Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, che forniscono diversi componenti di reazione e coloranti azide etichettati con una varietà di coloranti Alexa Fluor per l’incorporazione e il rilevamento di EdU10. Tuttavia, i reagenti forniti con tali kit non sono compatibili con alcuni tag fluorescenti spesso utilizzati con anticorpi secondari. Questo kit di rilevamento EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit fornito con colorante azide coniugato Alexa Fluor 647) è stato testato in Drosophila terzo NB larvale instar e la co-colorazione è stata tentata con anticorpi contro pH3 e Miranda, un marcatore per NB. Inoltre, gli anticorpi secondari alexa Fluor 568 o Cy3 sono stati utilizzati per il rilevamento dell’etichettatura Miranda sulla membrana plasmatica degli NB11. Tuttavia, l’intensità del segnale atteso e il modello di colorazione (risultati non pubblicati) non sono stati osservati con questi anticorpi secondari quando l’immunocolorazione è stata eseguita dopo il rilevamento di EdU.
Per l’incorporazione di EdU, il protocollo descritto da Daul e colleghi richiedeva l’alimentazione delle larve con kankel-white medio mescolato con EdU e bromofenolo blu (BPB)10. Le larve si nutrivano con il cibo a spillo EdU e BPB, che poteva essere visto dal suo colore blu all’ingestione nell’intestino larvale. Sebbene questo metodo sia stato utilizzato per l’incorporazione di EdU nella perdita di funzione di Mms19 (Mms19P) terza larva instar, le larve di Mms19P apparentemente non si sono nutrite poiché quasi nessun colore blu è stato rilevato nell’intestino larvale (risultati non pubblicati). Le larve di Mms19P mostrano drastiche deformità dello sviluppo e alla fine si arrestano nel terzo stadio instar. Ciò può in qualche modo influenzare il comportamento alimentare delle larve della terza stella e rendere il protocollo di alimentazione EdU inadatto a tali casi.
Dopo aver studiato la letteratura disponibile e aver lavorato ampiamente sulla standardizzazione dei passaggi essenziali, è stato proposto un approccio alternativo per la doppia etichettatura EdU/ pH3 nei NB Di Drosophila, che non richiede l’alimentazione di EdU alle larve. Uno studio precedente ha impiegato la doppia colorazione EdU / pH3 per analizzare il ciclo cellulare nei NB, ma non ha presentato un protocollo dettagliato4. Questo rappresenta un ostacolo inutile per i laboratori che cercano di implementare questo metodo. Inoltre, valutare la compatibilità di vari reagenti con il kit EdU ed eseguire un’ulteriore ottimizzazione può essere un processo che richiede molto tempo. Questo documento presenta un protocollo passo-passo che copre l’incorporazione di EdU nel cervello larvale sezionato e l’immunocolorazione con anticorpi anti-pH3, seguita dalla microscopia confocale e dall’analisi delle immagini per assegnare NB a quattro categorie distinte: fase G0 / G1, fase S, S >G2 / M (progressione da S a G2 / M) e fase M. I passaggi che richiedono l’ottimizzazione sono delineati e vengono forniti suggerimenti per l’analisi delle immagini di set di dati di grandi dimensioni. Inoltre, la lettura EdU/pH3 nei NB wild-type viene analizzata e confrontata con i NB P Mms19, che sono stati recentemente segnalati per mostrare un ritardo del ciclo cellulare11.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’incorporazione di EdU e la sua successiva reazione “click” con azide permeabile alle cellule presenta vantaggi pratici di questa tecnica rispetto al metodo BrdU utilizzato in precedenza7. Tuttavia, questa reazione è catalizzata dagli ioni Cu(I) e diversi coloranti possono essere instabili in presenza di questo catalizzatore di rame, come è chiaramente consigliato dal produttore del kit Click-it EdU. Quando sono stati eseguiti esperimenti di immunocolorazione dopo aver eseguito la fase di rilev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (sovvenzione del progetto 31003A_173188; www.snf.ch) e dell’Università di Berna (www.unibe.ch) a BS. I finanziatori non avevano alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
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