5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Fosfo-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for cell cycle progresjonsanalyse i Drosophila Neural Stamceller
Summary
Cellesyklusanalyse med 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EdU) og fosfo-histon H3 (pH3) merking er en flertrinnsprosedyre som kan kreve omfattende optimalisering. Her presenterer vi en detaljert protokoll som beskriver alle trinnene for denne prosedyren, inkludert bildeanalyse og kvantifisering for å skille celler i forskjellige cellesyklusfaser.
Abstract
In vivo cellesyklusprogresjonsanalyse utføres rutinemessig i studier på gener som regulerer mitose og DNA-replikasjon. 5-Ethynyl-2′-deoksyuridin (EdU) har blitt brukt til å undersøke replikerings-/S-faseprogresjon, mens antistoffer mot fosfo-histon H3 har blitt brukt til å markere mititotiske kjerner og celler. En kombinasjon av begge etikettene vil gjøre det mulig for klassifiseringen av G0/G1 (Gap fase), S (replikeringsmiddel) og M (mitotic) faser og tjene som et viktig verktøy for å evaluere effekten av mititotiske gen knockdowns eller null mutanter på celle syklus progresjon. Reagensene som brukes til å markere EdU-merkede celler er imidlertid inkompatible med flere sekundære antistoff-fluorescerende koder. Dette kompliserer immunstaining, der primære og taggede sekundære antistoffer brukes til å markere pH3-positive mititotiske celler. Dette dokumentet beskriver en trinnvis protokoll for dobbeltmerking av EdU og pH3 i Drosophila larval nevrale stamceller, et system som brukes mye til å studere mititotiske faktorer. I tillegg er det gitt en protokoll for bildeanalyse og kvantifisering for å tildele merkede celler i 3 forskjellige kategorier, G0/G1, S, S>G2/M (progresjon fra S til G2/M) og M-faser.
Introduction
Celledelingssyklusen består av en G1-fase (første gapfase), en replikerings-/S-fase, en G2 -fase (andregapfase) og en M-fase (mitotisk). Gjennom disse fasene gjennomgår cellen dramatiske endringer i cellulær transkripsjon, oversettelse og reorganisering av cytoskeletal maskiner1,2. Som svar på utviklings- og miljøsignaler kan celler midlertidig slutte å dele seg og bli passiv (G0) eller differensiere og permanent slutte å dele3. Andre scenarier, for eksempel DNA-skade, kan forårsake for tidlig differensiering eller apoptose3,4. Respons på slike signaler formidles av cellesykluskontrollpunkter, som fungerer som et overvåkingssystem for å sikre integriteten til essensielle cellulære prosesser før cellen forplikter seg til neste fase av divisjonssyklusen5. Derfor må studier på gener som regulerer DNA-replikasjon, sjekkpunkter og mitotiske maskineri analysere mulige cellesyklusprogresjonsfeil som kan oppstå i mutantceller eller ved siRNA-nedslag av disse genene. I tillegg kan slike analyser brukes til å teste generell cellehelse samt cellulær respons på narkotikabehandling.
5-bromo-2′-deoksyuridin (BrdU) er en tymidanalog som er innlemmet i DNA under replikasjon6. Denne metoden ble mye brukt til å identifisere celler i S-fase. Cellene blir imidlertid utsatt for harde DNA-denatureringsprosedyrer for å tillate deteksjon av BrdU ved bruk av anti-BrdU-antistoffer6. Denne harde behandlingen kan skade cellulære epitoper og forhindre ytterligere karakterisering av prøven gjennom immunstaining. EdU-inkorporering og påfølgende deteksjon av en kobberkaalysert, “klikkreaksjon” med små, cellegjennomtrengelige, fluorescerende merkede azidefarger eliminerer behovet for harde denatureringsprosedyrer7. Denne metoden dukket derfor opp som et mer praktisk alternativ til BrdU-innlemmelse.
Videre har pH3 blitt beskrevet som en pålitelig markør for mititotiske / M faseceller8. Histone H3 er et DNA-assosiert kjerne histone protein som blir fosforylatert rundt slutten av G2-fasen til tidlig M-fase og er de-fosforilert mot slutten av anafase8. Flere kommersielle antistoffer kan brukes til å oppdage pH3 ved hjelp av standard immundempende protokoller. Dobbel farging av EdU og pH3 vil derfor muliggjøre deteksjon av celler i S-fase så vel som M-fase. I tillegg vil celler i G1 og tidlig G2-fase ikke farge positivt for noen av markørene.
Drosophila nevrale stamceller eller nevroblaster (NBs) tilbyr en godt karakterisert stamcellemodell der cellene deler seg asymmetrisk for å produsere en identisk selvfornyende NB og en ganglion morcelle (GMC), som er skjebnebestemt for differensiering9. I tillegg gjør flere genetiske verktøy og NB-spesifikke antistoffer dette systemet egnet for genetisk manipulasjon og levende celleavbildning. Følgelig har flere studier brukt NBs til å studere gener som regulerer asymmetriske divisjoner og celle skjebnebestemmelse9. Distinkte populasjoner av NBs eksisterer i den sentrale hjernen (CB) og den optiske loben (OL) i larvalhjernen9; CB NBs ble brukt til den nåværende studien. Disse tredje instar larval CB NBs er store celler som også er egnet for å studere faktorer som regulerer mitotisk spindelmontering. En protokoll for å analysere cellesyklusprogresjonsfeil ville være et viktig verktøy i slike studier.
Protokoller publisert tidligere brukte kommersielle sett, for eksempel Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, som gir flere reaksjonskomponenter og azidefarger merket med en rekke Alexa Fluor-fargestoffer for EdU-inkorporering ogdeteksjon 10. Reagensene som leveres med slike sett er imidlertid ikke kompatible med noen fluorescerende koder som ofte brukes med sekundære antistoffer. Dette EdU-deteksjonssettet (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit levert med Alexa Fluor 647-konjugert azidefarge) ble testet i Drosophila tredje instar larval NBs, og co-farging ble forsøkt med antistoffer mot pH3 og Miranda, en markør for NBs. Videre ble Alexa Fluor 568- eller Cy3-taggede sekundære antistoffer brukt til påvisning av Miranda-merking på plasmamembranen til NBs11. Forventet signalintensitet og fargingsmønster (upubliserte resultater) ble imidlertid ikke observert med disse sekundære antistoffene da immunstaining ble utført etter EdU-deteksjon.
For EdU-inkorporering krevde protokollen beskrevet av Daul og kolleger fôring av larver med Kankel-White medium blandet med EdU og bromophenol blå (BPB)10. Larvene matet på EdU og BPB-spiked mat, som kunne ses av sin blå farge ved inntak i larval tarmen. Selv om denne metoden ble brukt til EdU-inkorporering i Mms19 funksjonstap (Mms19P) tredje instar larver, matet Mms19P larver tilsynelatende ikke da knapt noen blå farge ble oppdaget i larval tarmen (upubliserte resultater). Mms19P larver viser drastiske utviklingsdeformiteter og til slutt arrestasjon i tredje instar-stadium. Dette kan på en eller annen måte påvirke fôringsatferden til de tredje instar larver og gjøre EdU-fôringsprotokollen uegnet for slike tilfeller.
Etter å ha studert tilgjengelig litteratur og arbeidet mye med standardisering av viktige trinn, ble det foreslått en alternativ tilnærming for EdU / pH3 dual-labeling i Drosophila NBs, som ikke krever fôring av EdU til larver. En tidligere studie benyttet dobbel EdU / pH3 farging for å analysere cellesyklusen i NBs, men presenterte ikke en detaljert protokoll4. Dette presenterer et unødvendig hinder for laboratorier som prøver å implementere denne metoden. Videre kan evaluering av kompatibiliteten til ulike reagenser med EdU-settet og utføre ytterligere optimalisering være en tidkrevende prosess. Dette dokumentet presenterer en trinnvis protokoll som dekker EdU-inkorporering i dissekerte larvalhjerner og immunoppfatning med anti-pH3-antistoffer, etterfulgt av konfokal mikroskopi og bildeanalyse for å tildele NBer til fire forskjellige kategorier: G0/G1-fase, S-fase, S>G2/M (progresjon fra S til G2/M) og M-fase. Trinnene som trenger optimalisering er skissert og tips gitt for bildeanalyse av store datasett. I tillegg analyseres EdU/pH3-avlesningen i wild-type NBer og sammenlignes med Mms19P NBs, som nylig ble rapportert å vise en cellesyklusforsinkelse11.
Protocol
Representative Results
Discussion
EdU inkorporering og dens påfølgende “klikk” reaksjon med cellegjennomtrengelig azide presenterer praktiske fordeler med denne teknikken over BrdU-metoden som ble brukt tidligere7. Imidlertid er denne reaksjonen katalysert av Cu (I) ioner, og flere fargestoffer kan være ustabile i nærvær av denne kobberkatalysatoren, som det tydelig anbefales av Click-it EdU-settprodusenten. Når immunsendende eksperimenter hadde blitt utført etter å ha utført EdU-deteksjonstrinnet, ble den forventede sign…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Swiss National Science Foundation (prosjektstipend 31003A_173188; www.snf.ch) og Universitetet i Bern (www.unibe.ch) til BS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
