5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol för cellcykelprogressionsanalys i Drosophila neurala stamceller
Summary
Cellcykel analys med 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) och phospho-histon H3 (pH3) märkning är en flera steg förfarande som kan kräva omfattande optimering. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som beskriver alla steg för denna procedur inklusive bildanalys och kvantifiering för att skilja celler i olika cellcykelfaser.
Abstract
In vivo cellcykelprogressionsanalys utförs rutinmässigt i studier på gener som reglerar mitos och DNA-replikering. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) har använts för att undersöka replikativ/S-fas progression, medan antikroppar mot fosfo-histon H3 har använts för att markera mitotiska atomkärnor och celler. En kombination av båda etiketterna skulle möjliggöra klassificering av G0/G1 (Gap phase), S (replikativ) och M (mitotisk) faser och fungera som ett viktigt verktyg för att utvärdera effekterna av mitotiska gen knockdowns eller null mutanter på cellcykelprogression. De reagenser som används för att märka EdU-märkta celler är dock oförenliga med flera sekundära antikroppslysrör. Detta komplicerar immunstaining, där primära och märkta sekundära antikroppar används för att markera pH3-positiva mitotiska celler. Detta dokument beskriver ett steg-för-steg protokoll för dubbelmärkning av EdU och pH3 i Drosophila larval neurala stamceller, ett system som används i stor utsträckning för att studera mitotiska faktorer. Dessutom tillhandahålls ett protokoll för bildanalys och kvantifiering för att allokera märkta celler i 3 distinkta kategorier, G0/G1, S, S>G2/M (progression från S till G2/M) och M-faser.
Introduction
Celldelningscykeln består av en G1-fas (första gapfasen), en replikativ/S-fas, en G2-fas (andra gapfasen) och en M-fas (mitotisk). Genom dessa faser genomgår cellen dramatiska förändringar i cellulär transkription, översättning och omorganisation av cytoskeletala maskiner1,2. Som svar på utvecklings- och miljösignaler kan celler tillfälligt upphöra att dela sig och bli quiescent (G0) eller differentiera och permanent upphöra att dela3. Andra scenarier, såsom DNA-skador, kan orsaka för tidig differentiering eller apoptos3,4. Svar på sådana signaler förmedlas av cellcykelkontrollpunkter, som fungerar som ett övervakningssystem för att säkerställa integriteten hos väsentliga cellulära processer innan cellen förbinder sig till nästa fas av delningscykeln5. Därför måste studier på gener som reglerar DNA-replikation, kontrollpunkter och mitotiska maskiner analysera möjliga cellcykelprogressionsdefekter som kan uppstå i mutanta celler eller vid siRNA-knockdown av dessa gener. Dessutom kan sådana analyser användas för att testa övergripande cellhälsa samt cellulära svar på läkemedelsbehandling.
5-bromo-2′-deoxyuridin (BrdU) är en tymidinanalog som införlivas i DNA under replikering6. Denna metod användes i stor utsträckning för att identifiera celler i S-fas. Cellerna utsätts dock sedan för hårda DNA-denatureringsförfaranden för att möjliggöra detektion av BrdU genom användning av anti-BrdU-antikroppar6. Denna hårda behandling kan skada cellulära epitoper och förhindra ytterligare karakterisering av provet genom immunstaining. EdU-inkorporering och efterföljande detektion av en kopparkatalyserad klickreaktion med små, cellgenomsläppliga, fluorescerande märkta azidfärger eliminerar behovet av hårda denatureringsförfaranden7. Denna metod framstod därför som ett mer praktiskt alternativ till BrdU-införlivandet.
Dessutom har pH3 beskrivits som en tillförlitlig markör för mitotiska/M-fasceller8. Histon H3 är ett DNA-associerat core histonprotein som blir fosforylerat i runt den sena G2-fasen till tidig M-fasen och avfosforyleras mot slutet av anafas8. Flera kommersiella antikroppar kan användas för att detektera pH3 med hjälp av vanliga immunstainingprotokoll. Dubbelfärgning av EdU och pH3 skulle därför göra det möjligt att upptäcka celler i S-fas samt M-fas. Dessutom skulle celler i G1 och tidig G2-fasen inte färga positivt för någon av markörerna.
Drosophila neurala stamceller eller neuroblaster (NBs) erbjuder en väl karakteriserad stamcellsmodell där celler delar sig asymmetriskt för att producera en identisk självförnyande NB och en ganglion modercell (GMC), som är fett för differentiering9. Dessutom gör flera genetiska verktyg och NB-specifika antikroppar detta system lämpligt för genetisk manipulation och levande cellavbildning. Följaktligen har flera studier använt NBs för att studera gener som reglerar asymmetriska uppdelningar och cell ödesbestämning9. Distinkta populationer av NBs finns i den centrala hjärnan (CB) och den optiska loben (OL) i larvhjärnan9; CB NBs användes för den aktuella studien. Dessa tredje instar larval CB NBs är stora celler som också är lämpliga för att studera faktorer som reglerar mitotisk spindel montering. Ett protokoll för att analysera cellcykelprogressionsdefekter skulle vara ett viktigt verktyg i sådana studier.
Protokoll publicerade tidigare använda kommersiella kit, såsom Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, som ger flera reaktionskomponenter och azidfärger taggade med en mängd olika Alexa Fluor-färgämnen för EdU-inkorporering och detektion10. De reagenser som levereras med sådana satser är dock inte kompatibla med vissa fluorescerande taggar som ofta används med sekundära antikroppar. Detta EdU-detekteringskit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit som levereras med Alexa Fluor 647-konjugerat azidfärg) testades i Drosophila tredje instar larval NBs, och co-staining försöktes med antikroppar mot pH3 och Miranda, en markör för NBs. Vidare användes Alexa Fluor 568- eller Cy3-märkta sekundära antikroppar för detektion av Miranda-märkning på plasmamembranet i NBs11. Den förväntade signalintensiteten och färgning mönstret (opublicerade resultat) observerades dock inte med dessa sekundära antikroppar när immunostaining utfördes efter EdU påvisande.
För EdU-inkorporering krävde det protokoll som beskrivs av Daul och kollegor utfodring av larverna med Kankel-White medium blandat med EdU och bromofenolblå (BPB)10. Larverna matas på EdU och BPB-spetsad mat, som kunde ses av sin blå färg vid intag i larvens tarm. Även om denna metod användes för EdU-inkorporering i Mms19 förlust av funktion (Mms19P) tredje instar larver, mms19P larverna uppenbarligen inte matar eftersom knappast någon blå färg upptäcktes i larv gut (opublicerade resultat). Mms19P larverna visar drastiska utvecklingsdeformiteter och så småningom arrestera i det tredje instar-stadiet. Detta kan på något sätt påverka utfodringsbeteendet hos de tredje instar larverna och göra EdU-utfodringsprotokollet olämpligt för sådana fall.
Efter att ha studerat tillgänglig litteratur och arbetat mycket med standardisering av väsentliga steg, föreslogs ett alternativt tillvägagångssätt för EdU/pH3 dubbelmärkning i Drosophila NBs, som inte kräver utfodring EdU till larver. En tidigare studie använde dubbel EdU/pH3 färgning för att analysera cellcykeln i NBs, men presenterade inte ett detaljerat protokoll4. Detta innebär ett onödigt hinder för labb som försöker implementera den här metoden. Dessutom kan det vara en tidskrävande process att utvärdera kompatibiliteten hos olika reagenser med EdU-satsen och utföra ytterligare optimering. Detta dokument presenterar ett steg-för-steg protokoll som täcker EdU införlivande i dissekerade larval hjärnor och immunostaining med anti-pH3 antikroppar, följt av confocal mikroskopi och bild analys för att fördela NBs till fyra distinkta kategorier: G0/G1 fas, S fas, S>G2/M (progression från S till G2/M) och M fas. Stegen som behöver optimering beskrivs och tips ges för avbildnings analys av stora data uppsättningar. Dessutom analyseras EdU/pH3-avläsningen i NB av vild typ och jämförs med Mms19P NBs, som nyligen rapporterades visa en cellcykelfördröjning11.
Protocol
Representative Results
Discussion
EdU-inkorporering och dess efterföljande “klickreaktion” med cellgenomsläpplig azid ger praktiska fördelar med denna teknik jämfört med BrdU-metoden som användes tidigare7. Denna reaktion katalyseras dock av Cu(I) joner, och flera färgämnen kan vara instabila i närvaro av denna kopparkatalysator, vilket tydligt rekommenderas av Click-it EdU-kittillverkaren. När immunostaining experiment hade utförts efter att ha utfört EdU detektionssteget observerades inte den förväntade signalinten…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av finansiering från Swiss National Science Foundation (projektbidrag 31003A_173188; www.snf.ch) och Universitetet i Bern (www.unibe.ch) till BS. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
