5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen
Summary
Celcyclusanalyse met 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) en fosfo-histon H3 (pH3) etikettering is een procedure in meerdere stappen die uitgebreide optimalisatie kan vereisen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat alle stappen voor deze procedure beschrijft, inclusief beeldanalyse en kwantificering om cellen in verschillende celcyclusfasen te onderscheiden.
Abstract
In vivo celcyclusprogressieanalyse wordt routinematig uitgevoerd in studies naar genen die mitose en DNA-replicatie reguleren. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) is gebruikt om replicatieve / S-fase progressie te onderzoeken, terwijl antilichamen tegen fosfo-histon H3 zijn gebruikt om mitotische kernen en cellen te markeren. Een combinatie van beide labels zou de classificatie van G0/G1 (Gap-fase), S (replicatief) en M (mitotisch) mogelijk maken en dienen als een belangrijk hulpmiddel om de effecten van mitotische gen-knockdowns of nulmutanten op de progressie van de celcyclus te evalueren. De reagentia die worden gebruikt om EdU-gelabelde cellen te markeren, zijn echter niet compatibel met verschillende secundaire antilichaam-fluorescerende tags. Dit bemoeilijkt immunostaining, waarbij primaire en gelabelde secundaire antilichamen worden gebruikt om pH3-positieve mitotische cellen te markeren. Dit artikel beschrijft een stap-voor-stap protocol voor de dual-labeling van EdU en pH3 in Drosophila larvale neurale stamcellen, een systeem dat uitgebreid wordt gebruikt om mitotische factoren te bestuderen. Daarnaast is er een protocol voor beeldanalyse en kwantificering om gelabelde cellen toe te wijzen in 3 verschillende categorieën, G0/ G1, S, S>G2 / M (progressie van S naar G2 / M) en M-fasen.
Introduction
De celdelingscyclus bestaat uit een G1-fase (eerste gapfase), een replicatieve/S-fase, een G2-fase (tweede gapfase) en een M-fase (mitotische fase). Door deze fasen ondergaat de cel dramatische veranderingen in cellulaire transcriptie, vertaling en reorganisatie van cytoskeletmachines1,2. Als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen kunnen cellen tijdelijk ophouden te delen en rustig (G0) of differentiëren worden en permanent ophouden te delen3. Andere scenario’s, zoals DNA-schade, kunnen voortijdige differentiatie of apoptoseveroorzaken 3,4. Reactie op dergelijke signalen wordt gemedieerd door controlepunten voor de celcyclus, die fungeren als een bewakingssysteem om de integriteit van essentiële cellulaire processen te waarborgen voordat de cel zich verbindt aan de volgende fase van de delingcyclus5. Daarom moeten studies naar genen die DNA-replicatie, checkpoints en mitotische machines reguleren, mogelijke celcyclusprogressiedefecten analyseren die kunnen optreden in mutante cellen of bij siRNA-knockdown van deze genen. Bovendien kunnen dergelijke analyses worden gebruikt om de algehele celgezondheid en cellulaire reacties op medicamenteuze behandeling te testen.
5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) is een thymidine-analoog dat tijdens replicatie in het DNA wordt opgenomen6. Deze methode werd uitgebreid gebruikt om cellen in de S-fase te identificeren. De cellen worden vervolgens echter onderworpen aan strenge DNA-denaturatieprocedures om detectie van BrdU mogelijk te maken door het gebruik van anti-BrdU-antilichamen6. Deze harde behandeling kan cellulaire epitopen beschadigen en verdere karakterisering van het monster door immunostaining voorkomen. EdU-opname en daaropvolgende detectie door een kopergekatalyseerde,’klikreactie’ met kleine, celdoorlatende, fluorescerend gelabelde azidekleurstoffen elimineert de noodzaak van agressieve denaturatieprocedures7. Deze methode kwam daarom naar voren als een praktischer alternatief voor BrdU-integratie.
Verder is pH3 beschreven als een betrouwbare marker voor mitotische / M-fasecellen8. Histon H3 is een DNA-geassocieerd kernhitoneiwit dat rond de late G2-fase tot vroege M-fase wordt gefosforyleerd en tegen het einde van anafase8wordt gedefosforyleerd. Verschillende commerciële antilichamen kunnen worden gebruikt om pH3 te detecteren met behulp van standaard immunostainingprotocollen. Dubbele kleuring van EdU en pH3 zou daarom de detectie van cellen in zowel S-fase als M-fase mogelijk maken. Bovendien zouden cellen in de G1- en vroege G2-fase voor geen van de markers positief kleuren.
Drosophila neurale stamcellen of neuroblasten (NBs) bieden een goed gekarakteriseerd stamcelmodel waarbij cellen zich asymmetrisch delen om één identieke zelfvernieuwende NB en een ganglionmoedercel (GMC) te produceren, die is vetgemest voor differentiatie9. Daarnaast maken verschillende genetische hulpmiddelen en NB-specifieke antilichamen dit systeem geschikt voor genetische manipulatie en live-cell imaging. Bijgevolg hebben verschillende studies NBs gebruikt om genen te bestuderen die asymmetrische delingen en bepaling van het lot van cellen reguleren9. Verschillende populaties van NB’s bestaan in de centrale hersenen (CB) en de optische kwab (OL) van de larvale hersenen9; Cb-nbb’s werden gebruikt voor de huidige studie. Deze derde instar larvale CB NBs zijn grote cellen die ook geschikt zijn voor het bestuderen van factoren die de mitotische spindelassemblage reguleren. Een protocol om progressiedefecten van de celcyclus te analyseren zou een essentieel hulpmiddel zijn in dergelijke studies.
Protocollen die eerder zijn gepubliceerd, gebruikten commerciële kits, zoals Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, die verschillende reactiecomponenten en azidekleurstoffen bieden die zijn getagd met een verscheidenheid aan Alexa Fluor-kleurstoffen voor EdU-opname en -detectie10. De reagentia die bij dergelijke kits worden geleverd, zijn echter niet compatibel met sommige fluorescerende tags die vaak worden gebruikt met secundaire antilichamen. Deze EdU-detectiekit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit geleverd met Alexa Fluor 647-geconjugeerde azidekleurstof) werd getest in Drosophila derde instar larvale NB’s, en co-kleuring werd geprobeerd met antilichamen tegen pH3 en Miranda, een marker voor NBs. Verder werden Alexa Fluor 568- of Cy3-gelabelde secundaire antilichamen gebruikt voor de detectie van Miranda-etikettering op het plasmamembraan van NBs11. De verwachte signaalintensiteit en het kleuringspatroon (niet-gepubliceerde resultaten) werden echter niet waargenomen met deze secundaire antilichamen wanneer immunostaining werd uitgevoerd na EdU-detectie.
Voor EdU-opname vereiste het door Daul en collega’s beschreven protocol voeding van de larven met Kankel-White-medium gemengd met EdU en broomfenolblauw (BPB)10. De larven voedden zich met het EdU- en BPB-spiked voedsel, dat te zien was aan de blauwe kleur bij inname in de larvale darm. Hoewel deze methode werd gebruikt voor EdU-opname in Mms19-functieverlies (Mms19P) derde instarlarven, voedden de Mms19P-larven zich blijkbaar niet omdat er nauwelijks een blauwe kleur werd gedetecteerd in de larvale darm (ongepubliceerde resultaten). De Mms19P-larven vertonen drastische ontwikkelingsmisvormingen en stoppen uiteindelijk in het derde instarstadium. Dit kan op de een of andere manier het voedingsgedrag van de derde instarlarven beïnvloeden en het EdU-voedingsprotocol ongeschikt maken voor dergelijke gevallen.
Na bestudering van de beschikbare literatuur en uitgebreid werken aan de standaardisatie van essentiële stappen, werd een alternatieve aanpak voorgesteld voor EdU/pH3 dual-labeling in Drosophila NBs, waarvoor geen EdU aan larven hoeft te worden gevoerd. Een eerdere studie gebruikte dubbele EdU / pH3-kleuring om de celcyclus in OS’s te analyseren, maar presenteerde geen gedetailleerd protocol4. Dit vormt een onnodige hindernis voor laboratoria die deze methode proberen te implementeren. Bovendien kan het evalueren van de compatibiliteit van verschillende reagentia met de EdU-kit en het uitvoeren van verdere optimalisatie een tijdrovend proces zijn. Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol dat betrekking heeft op EdU-opname in ontleed larvale hersenen en immunostaining met anti-pH3-antilichamen, gevolgd door confocale microscopie en beeldanalyse om NBs toe te wijzen aan vier verschillende categorieën: G0 / G1-fase, S-fase, S>G2 / M (progressie van S naar G2 / M) en M-fase. De stappen die moeten worden geoptimaliseerd, worden beschreven en tips gegeven voor beeldanalyse van grote datasets. Bovendien wordt de EdU / pH3-uitlezing in wild-type NBs geanalyseerd en vergeleken met Mms19P NBs, waarvan onlangs werd gemeld dat ze een celcyclusvertraging11.
Protocol
Representative Results
Discussion
EdU-opname en de daaropvolgende ‘klik’-reactie met celdoorlatend azide biedt praktische voordelen van deze techniek ten opzichte van de BrdU-methode die eerder werd gebruikt7. Deze reactie wordt echter gekatalyseerd door Cu(I)-ionen en verschillende kleurstoffen kunnen onstabiel zijn in de aanwezigheid van deze koperkatalysator, zoals duidelijk wordt geadviseerd door de Click-it EdU-kitfabrikant. Wanneer immunostaining-experimenten waren uitgevoerd na het uitvoeren van de EdU-detectiestap, werd de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Swiss National Science Foundation (projectsubsidie 31003A_173188; www.snf.ch) en de Universiteit van Bern (www.unibe.ch) aan BS. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
