Inriktning på kortikospinalkanalen hos neonatala råttor med en dubbelviral vektor med kombinerad hjärn- och ryggradskirurgi

Summary

Detta protokoll visar en ny metod för att tillämpa genterapier på subpopulationer av celler hos neonatala råttor i postnatala åldrar 5-10 dagar genom att injicera en anterograd kemogenetisk modifierare i den somatomotoriska cortexen och ett retrogradt transportabelt Cre-rekombinas i livmoderhalsen.

Abstract

Att framgångsrikt ta itu med de hinder som begränsar forskning på neonatala råttor är viktigt för att studera skillnaderna i resultat som ses vid pediatriska ryggmärgsskador (SCI) jämfört med vuxna SCIs. Dessutom kan det vara utmanande att på ett tillförlitligt sätt införa terapier i målcellerna i centrala nervsystemet (CNS), och felaktigheter kan äventyra effekten av studien eller terapin. Detta protokoll kombinerar viral vektorteknik med en ny kirurgisk teknik för att exakt introducera genterapier i neonatala råttor vid postnatal dag 5. Här introduceras ett virus konstruerat för retrograd transport (retroAAV2) av Cre vid axonterminalerna hos kortikospinalneuroner i ryggmärgen, där det därefter transporteras till cellkropparna. En dubbelfloxad inverterad orienteringsreceptor (DIO) som uteslutande aktiveras av designerläkemedel (DREADD) -virus injiceras sedan i hjärnans somatomotoriska cortex. Denna dubbelinfektionsteknik främjar uttrycket av DREADDs endast i de saminfekterade kortikospinalkanalerna (CST). Således är samtidig saminjektion av de somatomotoriska cortex- och cervikala CST-terminalerna en giltig metod för att studera den kemogenetiska moduleringen av återhämtning efter cervikala SCI-modeller hos neonatala råttor.

Introduction

Även om SCI är en relativt sällsynt förekomst i den pediatriska befolkningen, är den särskilt traumatisk och orsakar en permanent funktionsnedsättning som kräver enorm logistisk framsynthet. Dessutom klassificeras en högre andel av pediatriska områden av gemenskapsintresse som livmoderhalscancer och fullständiga jämfört med den vuxna befolkningen ^1,2. Ett kännetecken för däggdjursarter är att nyfödda återhämtar sig betydligt bättre från SCI än vuxna, och detta ger en möjlighet att bedöma de drivande mekanismerna för återhämtning i yngre populationer ^3,4,5. Trots detta finns det färre multimodala studier som behandlar forskning om nyfödda och nyfödda gnagare, delvis på grund av den extra svårigheten att exakt rikta in sig på utvalda populationer av neuroner i de mycket snävare anatomiska landmärkena hos yngre djur⁶. Denna artikel fokuserar på direkt injektion av högeffektiva anterograd och retrograd adenoassocierade vektorer i råttans ryggmärg för att modulera stora motorvägar med tillämpning av Cre-dependent-DREADDs, vilket utökar räckvidden för multimodala regenereringsstudier.

Virala vektorer är viktiga biologiska verktyg med en bredd av applikationer, inklusive introduktion av genetiskt material för att ersätta målgener, uppreglera tillväxtproteiner och spåra det anatomiska landskapet i CNS ^7,8,9. Många av de anatomiska detaljerna i ryggradsmotoriska vägar har studerats med klassiska spårämnen, dvs biotinylerad dextranamin. Medan traditionella spårämnen har varit avgörande för att avslöja neuroanatomi, är de inte utan nackdelar: de märker urskillningslöst vägar även om de injiceras korrekt, och studier har visat att de tas upp av skadade axoner^10,11,12. Följaktligen kan detta leda till felaktiga tolkningar i regenereringsstudier där avskurna axoner kan misstas för regenererande fibrer.

Följande metod använder det tvåvirala vektorsystemet som nyligen populariserats i moduleringsstudier, med två olika virala vektorer i två separata områden av samma neuron^13,14. Den första är en vektor som lokalt infekterar cellkropparna i projektionsneuroner. Den andra är en retrograd vektor som transporteras från axonterminalerna i projektionsneuronerna (figur 1). Den retrograda vektorn bär Cre-rekombinas, och den lokala vektorn innehåller “Cre-On” dubbelfloxad sekvens där ett fluorescerande protein (mCherry) kodas. Den ursprungliga transgenen som uttrycker både hM3Dq och mCherry är inverterad i förhållande till promotorn och flankeras av två LoxP-platser (figur 2). Således uttrycks mCherry endast i de dubbelt transducerade projektionsneuronerna där Cre-rekombinas inducerar en rekombinationshändelse mellan LoxP-platserna, vänder transgenens orientering till lämplig läsram och tillåter uttryck av både DREADD och det fluorescerande proteinet. När virustransgenen är i rätt riktning, och i förekommande fall, kan DREADD: erna tillfälligt inducera neuromodulering genom en separat injicerad ligand, dvs klozapin-N-oxid. Protokollet utformades för att autentisera inducerbar neuromoduleringsforskning hos nyfödda, där DREADDS injiceras för att modulera CST: erna selektivt. Det tvåvirala systemet fungerar som en försäkring och säkerställer att varje DREADD-positiv cell kan spåras under fluorescens med hög trohet för att validera injektionerna.

Denna metod hjälper också till att överbrygga klyftan i neonatalforskning. Pediatrisk SCI presenterar sina utmaningar, och forskning som analyserar regenerering, spridning eller plasticitet bör betona skillnaderna mellan nyfödda och vuxna 3,15,16,17. Genom att optimera det kirurgiska ingreppet och utföra tidigare anatomiska studier med Nisselfärgning validerades koordinaterna för både kranial- och ryggradsinjektionerna. Syftet var att tillhandahålla en metod för dubbla injektioner i en neonatal råtta med ökad trohet och överlevnadsförmåga.

För den nuvarande modellen injicerades anterogradvektorn i cellkropparna i den somatomotoriska cortexen med bregma som referens^18,19. När det gäller ryggradsinjektionerna injicerades den retrograda vektorn i laminae V-VII, där CST-axonterminalerna finns^20,21. Det finns många grundläggande frågor bakom hur vissa lesionsmodeller påverkar yngre djur annorlunda, och hur den efterföljande återhämtningen avviker från ett äldre djur. Denna studie visar ett robust sätt att studera livmoderhalsskador och återhämtningsförmågan hos frambensfunktionen hos nyfödda gnagare. Däremot har majoriteten av tidigare studier behandlat återhämtningsrörelse efter ländryggs- eller bröstskador 5,22,23,24. Genom att para ihop den dubbelvirala vektorn med den nya injektionstekniken som beskrivs här hjälper detta protokoll till att mildra vissa problem (dvs. överlevnadsförmåga) som kan plåga neonatala gnagareundersökningar. Denna metod är robust, praktisk och mångsidig: små variationer i tekniken gör det möjligt att rikta in sig på olika vägar, dvs ventral CST, dorsal CST och de stigande dorsala vägarna.

För detta system injiceras ett lokalt verkande virus (t.ex. AAV2) i regionen av de neuronala cellkropparna av intresse. Ett andra retrogradt transporterat virus som styr uttrycket av det lokala viruset injiceras vid axonterminalerna för den neuronala befolkningen. Således är per definition endast kortikospinala neuroner märkta. RetroAAV-Cre-viruset valdes med en konstitutivt aktiv CMV-promotor eftersom skyttelplasmiden används för att generera flera AAV-serotyper för Cre-beroende uttryck i flera celltyper. För kortikala injektioner valdes AAV2 med transgenen som drivs av synapsin-1-promotorn för att begränsa något uttryck till neuroner. Eftersom 2-virussystemet förlitar sig mer på ursprunget och avslutningen av den neuronala populationen av intresse, kan flera olika promotorer användas, om de kan driva uttrycket av generna av intresse inom den neuronala populationen av intresse. Till exempel kan den excitatoriska neuronala promotorn, CamKII, ersättas med synapsin-1. Förutom användningen av dessa AAV-serotyper kan retrograd transport till omogna och i mycket mindre utsträckning kan vuxna kortikospinalmotorneuroner också uppnås med hjälp av det höga retrograda transportabla lentiviruset (HiRet)²⁵. HiRet lentivirus använder ett chimärt rabies/VSV-glykoprotein för att rikta in sig på upptaget vid synapsen för retrograd transport. I kombination med en Tet-On-promotor stöder detta 2-virala system inducerbart uttryck på ett retrogradberoende sätt^26,27.

Retrograda virus sätter in vektorer i det synaptiska rummet hos en målneuron, så att den kan tas upp av cellens axon och transporteras till cellkroppen. Medan lentivirala vektorer tidigare har haft enorm framgång och gett långsiktigt uttryck i genterapistudier, svängde denna metod mot adenoassocierade virusvektorer av några enkla skäl^26,28: AAV är mer ekonomiskt, lika effektivt och presenterar mindre av en logistisk börda, med tanke på att den har en lägre biosäkerhetsnivåbeteckning^29,30,31,32 . Medan AAV2, den mest använda serotypen, visar robust transfektion av CST-axoner, kan framtida forskare notera att AAV1 erbjuder viss mångsidighet eftersom den märker transynaptiskt och därmed lägger fram flera möjliga iterationer i framtida studier³³. Den slutliga anpassningen är att koda retrogradviruset med Cre-rekombinas så att flera anterogradvektorer kan införas samtidigt, vilket minskar onödigt internt virusavfall och maximerar sannolikheten för att DREADDs uttrycker sig i rätt riktning.

I slutändan visar detta protokoll samtidig injektion i cortex och cervikal ryggrad, specifikt inriktad på cellkropparna respektive axonterminalerna i kortikospinalkanalen. High-fidelity transfection ses i hjärnbarken och ryggmärgen. Medan det beskrivna protokollet var perfekt för Sprague Dawley-råttor 5 dagar, är det lämpligt för postnatala dagar 4-10 med mindre justeringar av anestesi och stereotaktiska koordinater.

Protocol

Alla följande kirurgiska och djurvårdsprocedurer har godkänts av djurvårds- och användningskommittén vid Temple University. Protokollet som beskrivs är en överlevnadsoperation, och djuren avlivades så småningom genom intraperitoneal injektion av 100 mg/kg natriumpentobarbital när deras tidpunkter var klara. 1. Pre-kirurgisk förberedelse Förbered minst två dragna glasnålar för viral injektion med 3,5 nL glaskapillärpipetter; en nål för DREADD och en nål för rCre. …

Representative Results

Framgångsrik injektion och transport av virusvektorn bör resultera i transduktion av ensidiga neuroner i ryggmärgen och motorcortexen. Figur 4 visar märkningen av lager V CST-neuroner i motorcortexen i en hjärnkoronal sektion som uttrycker Cre-dependent-DREADDs-mCherry injicerad tillsammans med en kontralateral ryggradsinjektion av rCre. Sektionerna färgades med dsRed antikropp. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files…

Discussion

Inducerbar genetisk modulering av hjärnaktivitet med injicerbara kemogenetiska modifierare är ett kraftfullt verktyg för att studera de olika mekanismerna som ligger till grund för återhämtningen från SCI. Noggrannheten i inriktningen för de inducerbara G-proteinkopplade receptorerna (DREADDs) ökar ytterligare när man överväger att fluorescensspårning validerar den anatomiska precisionen i histologi. Denna uppsats diskuterar en tillförlitlig metod för att utforska huruvida hämmande eller stimulerande utva…

Materials

#11 scalpel blades	Roboz	RS-9801-11	For use with the scalpel.
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic SC injection and fluid bolus
4.0 silk suture	Ethicon	771-683G	For skin closure
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation
Ketamine (Ketaset)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Lab Standard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	To hold the neonatal sterotaxic holder in place
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor		51615	For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)	Bryan Roth’s lab through Addgene		DREADD plasmid
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.
Liquid bandage	NewSkin	985838	To apply along sutures following surgery and encourage wound healing
Wire Cage Lamp	ZooMed	LF10EC	To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally