Нацеливание на кортикоспинальный тракт у неонатальных крыс с двойным вирусным вектором с использованием комбинированной хирургии головного мозга и позвоночника

Summary

Этот протокол демонстрирует новый метод применения генной терапии к субпопуляциям клеток у неонатальных крыс в постнатальном возрасте 5-10 дней путем введения антероградного хемогенетического модификатора в соматодвигательную кору и ретроградно транспортируемой рекомбиназы Cre в шейный спинной мозг.

Abstract

Успешное устранение препятствий, которые сдерживают исследования на неонатальных крысах, важно для изучения различий в результатах, наблюдаемых при детских травмах спинного мозга (SCIs) по сравнению со взрослыми SCIs. Кроме того, надежное введение терапии в клетки-мишени центральной нервной системы (ЦНС) может быть сложной задачей, а неточности могут поставить под угрозу эффективность исследования или терапии. Этот протокол сочетает в себе вирусную векторную технологию с новым хирургическим методом для точного введения генной терапии у неонатальных крыс на послеродовом дне 5. Здесь вирус, спроектированный для ретроградного транспорта (retroAAV2) Cre, вводится в аксонные терминали кортикоспинальных нейронов в спинном мозге, где он впоследствии транспортируется в клеточные тела. Затем в соматодвигательную кору головного мозга вводится дизайнерский рецептор с двойной инвертированной ориентацией (DIO), активируемый исключительно вирусом дизайнерских лекарств (ов) (DREADD). Этот метод двойной инфекции способствует экспрессии DREADD только в коинфицированных нейронах кортикоспинального тракта (CST). Таким образом, одновременная совместная инъекция соматомоторной коры и шейных терминалей CST является допустимым методом изучения хемогенетической модуляции восстановления по моделям цервикальной ТСМ у новорожденных крыс.

Introduction

Хотя ТСМ является относительно редким явлением в педиатрической популяции, она особенно травматична и вызывает постоянную инвалидность, требующую огромного логистического предвидения. Кроме того, более высокая доля детских ВЦИ классифицируется как цервикальная и полная по сравнению со взрослым населением ^1,2. Отличительной чертой всех видов млекопитающих является то, что новорожденные значительно лучше восстанавливаются после ТСМ, чем взрослые, и это дает возможность оценить движущие механизмы восстановления в более молодых популяциях ^3,4,5. Несмотря на это, существует меньше мультимодальных исследований, посвященных исследованиям новорожденных и детенышей грызунов, отчасти из-за дополнительной сложности точного нацеливания на отдельные популяции нейронов в гораздо более жестких анатомических ориентирах молодых животных⁶. Эта статья посвящена прямому введению высокоэффективных антероградных и ретроградных аденоассоциированных векторов в спинной мозг крыс для модуляции основных двигательных путей с применением Cre-dependent-DREADD, расширяя охват исследований мультимодальной регенерации.

Вирусные векторы являются важными биологическими инструментами с широким спектром применений, включая введение генетического материала для замены генов-мишеней, повышения регуляции белков роста и отслеживания анатомического ландшафта ЦНС ^7,8,9. Многие анатомические детали спинномозговых путей были изучены с использованием классических индикаторов, то есть биотинилированного декстранамина. В то время как традиционные индикаторы сыграли важную роль в раскрытии нейроанатомии, они не лишены своих недостатков: они без разбора маркируют пути, даже если они правильно введены, и исследования показали, что они поглощаются поврежденными аксонами 10,11,12. Следовательно, это может привести к неправильным интерпретациям в исследованиях регенерации, где отрезанные аксоны могут быть ошибочно приняты за регенерирующие волокна.

Следующий метод использует двухвирусную векторную систему, недавно популяризированную в исследованиях модуляции, с двумя различными вирусными векторами в двух отдельных областях одного и того же нейрона^13,14. Первый представляет собой вектор, который локально заражает клеточные тела проекционных нейронов. Другой представляет собой ретроградный вектор, переносимый из аксонных терминалей проекционных нейронов (рисунок 1). Ретроградный вектор несет рекомбиназу Cre, а локальный вектор включает в себя двойную флоксированную последовательность «Cre-On», в которой кодируется флуоресцентный белок (mCherry). Нативный трансген, экспрессирующий как hM3Dq, так и mCherry, инвертирован относительно промотора и окружен двумя loxP-сайтами (рисунок 2). Таким образом, mCherry выражается только в дважды трансдуцированных проекционных нейронах, где cre-рекомбиназа индуцирует событие рекомбинации между сайтами LoxP, переворачивая ориентацию трансгена в соответствующую рамку считывания и позволяя экспрессировать как DREADD, так и флуоресцентный белок. Как только вирусный трансген находится в правильной ориентации, и когда это применимо, DREADD могут временно индуцировать нейромодуляцию через отдельно введенный лиганд, то есть клозапин-N-оксид. Протокол был разработан для аутентификации индуцируемых исследований нейромодуляции у новорожденных, в которых DREADDS вводятся для селективной модуляции ГПСП. Двухвирусная система действует как страховой полис, гарантируя, что каждая DREADD-положительная клетка отслеживается под флуоресценцией с высокой точностью для проверки инъекций.

Этот метод также помогает преодолеть разрыв в неонатальных исследованиях. Педиатрическая ТСМ представляет свои проблемы, и исследования, анализирующие регенерацию, прорастание или пластичность, должны подчеркнуть различия между новорожденными и взрослыми 3,15,16,17. Оптимизируя хирургическую процедуру и выполняя предыдущие анатомические исследования с окрашиванием Nissl, координаты как для черепных, так и для спинальных инъекций были проверены. Цель состояла в том, чтобы обеспечить метод двойных инъекций неонатальной крысе с повышенной точностью и живучестью.

Для текущей модели антероградный вектор вводили в клеточные тела соматодвигательной коры, используя брегму в качестве эталона^18,19. С точки зрения спинальных инъекций, ретроградный вектор вводили в пластинки V-VII, где терминали аксона CST находятся^20,21. Существует много фундаментальных вопросов, лежащих в основе того, как определенные модели поражения по-разному влияют на молодых животных и как последующее восстановление отличается от более старого животного. Это исследование демонстрирует надежные средства изучения травм шейки матки и восстанавливаемости функции передней конечности у новорожденных грызунов. Напротив, большинство предыдущих исследований касались восстановления локомоции после травм поясницы или грудной клетки 5,22,23,24. Сочетая двойной вирусный вектор с новой техникой инъекций, описанной здесь, этот протокол помогает смягчить определенные проблемы (например, живучесть), которые могут препятствовать исследованиям новорожденных грызунов. Этот метод является надежным, практичным и универсальным: небольшие вариации в технике позволят нацеливаться на различные пути, то есть вентральный CST, дорсальный CST и восходящие дорсальные пути.

Для этой системы один локально действующий вирус (например, AAV2) вводится в область интересующих тел нейрональных клеток. Второй ретроградно транспортируемый вирус, который контролирует экспрессию местного вируса, вводится в терминалы аксона для этой нейронной популяции. Таким образом, по определению, маркируются только кортикоспинальные нейроны. РетроAAV-Cre вирус был выбран с конститутивно активным промотором ЦМВ, поскольку челночная плазмида используется для генерации нескольких серотипов AAV для Cre-зависимой экспрессии в нескольких типах клеток. Для корковых инъекций AAV2 был выбран с трансгеном, приводимым в действие промотором синапсина-1, чтобы ограничить любую экспрессию нейронами. Поскольку 2-вирусная система больше зависит от происхождения и прекращения интересующей нейронной популяции, можно использовать несколько различных промоторов, если они могут управлять экспрессией генов, представляющих интерес в интересующей нейронной популяции. Например, возбуждающий нейрональный промотор, CamKII, может быть заменен синапсином-1. В дополнение к использованию этих серотипов AAV, ретроградный транспорт в незрелый и в гораздо меньшей степени, взрослые кортикоспинальные двигательные нейроны также могут быть достигнуты с использованием высоко ретроградного транспортабельного лентивируса (HiRet)²⁵. Лентивирусы HiRet используют химерный гликопротеин Rabies / VSV для нацеливания поглощения синапсом для ретроградного транспорта. В сочетании с промотором Tet-On эта 2-вирусная система поддерживает индуцируемую экспрессию ретроградно-зависимым образом^26,27.

Ретроградные вирусы вставляют векторы в синаптическое пространство нейрона-мишени, позволяя ему поглощаться аксоном этой клетки и транспортироваться в тело клетки. В то время как лентивирусные векторы ранее имели огромный успех, обеспечивая долгосрочную экспрессию в исследованиях генной терапии, этот метод развернулся в сторону аденоассоциированных вирусных векторов по нескольким простым причинам^26,28: AAV более экономичен, так же эффективен и представляет меньшую логистическую нагрузку, учитывая, что он имеет более низкий уровень биобезопасности 29,30,31,32 . В то время как AAV2, наиболее часто используемый серотип, демонстрирует надежную трансфекцию аксонов CST, будущие исследователи могут отметить, что AAV1 предлагает некоторую универсальность, поскольку он маркирует трансинаптически, тем самым выдвигая несколько возможных итераций в будущих исследованиях³³. Окончательная адаптация заключается в кодировании ретроградного вируса кре-рекомбиназой таким образом, чтобы несколько антероградных векторов могли быть введены одновременно, тем самым уменьшая ненужные внутренние вирусные отходы и максимизируя вероятность того, что DREADD экспрессируются в правильной ориентации.

В конечном счете, этот протокол демонстрирует одновременную инъекцию в кору и шейный отдел позвоночника, особенно нацеленную на клеточные тела и аксонные терминали кортикоспинального тракта соответственно. Высокоточная трансфекция наблюдается в коре головного мозга и спинном мозге. В то время как описанный протокол был усовершенствован для крыс Sprague Dawley 5-дневного возраста, он подходит для послеродовых дней 4-10 с незначительными корректировками анестезии и стереотаксических координат.

Protocol

Все следующие хирургические процедуры и процедуры по уходу за животными были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Темпл. Описанный протокол представляет собой операцию по выживанию, и животные были в конечном итоге усыплены путем внутрибрюшинной инъекци…

Representative Results

Успешная инъекция и транспортировка вирусного вектора должны привести к трансдукции односторонних нейронов в спинном мозге и моторной коре. Рисунок 4 демонстрирует маркировку нейронов слоя V CST в моторной коре коронального отдела мозга, экспрессирующих Cre-dependent-DREADDs-mCherr…

Discussion

Индуцируемая генетическая модуляция мозговой активности инъекционными хемогенетическими модификаторами является мощным инструментом в изучении различных механизмов, лежащих в основе восстановления после ТСМ. Точность нацеливания на индуцируемые рецепторы, связанные с G-белком (DREAD…

Materials

#11 scalpel blades	Roboz	RS-9801-11	For use with the scalpel.
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic SC injection and fluid bolus
4.0 silk suture	Ethicon	771-683G	For skin closure
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation
Ketamine (Ketaset)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Lab Standard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	To hold the neonatal sterotaxic holder in place
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor		51615	For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)	Bryan Roth’s lab through Addgene		DREADD plasmid
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.
Liquid bandage	NewSkin	985838	To apply along sutures following surgery and encourage wound healing
Wire Cage Lamp	ZooMed	LF10EC	To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally