Gericht op het corticospinale kanaal bij neonatale ratten met een dubbel-virale vector met behulp van gecombineerde hersen- en wervelkolomchirurgie

Summary

Dit protocol demonstreert een nieuwe methode voor het toepassen van gentherapieën op subpopulaties van cellen bij neonatale ratten in de postnatale leeftijd van 5-10 dagen door een anterograde chemogenetische modifier in de somatomotorische cortex en een retrograde transporteerbaar Cre-recombinase in het cervicale ruggenmerg te injecteren.

Abstract

Het succesvol aanpakken van de obstakels die onderzoek op neonatale ratten beperken, is belangrijk voor het bestuderen van de verschillen in uitkomsten die worden gezien bij pediatrische ruggenmergletsels (GCI’s) in vergelijking met volwassen GCB’s. Bovendien kan het betrouwbaar introduceren van therapieën in de doelcellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) een uitdaging zijn en kunnen onnauwkeurigheden de werkzaamheid van de studie of therapie in gevaar brengen. Dit protocol combineert virale vectortechnologie met een nieuwe chirurgische techniek om gentherapieën nauwkeurig te introduceren bij neonatale ratten op postnatale dag 5. Hier wordt een virus dat is ontworpen voor retrograde transport (retroAAV2) van Cre geïntroduceerd op de axonterminals van corticospinale neuronen in het ruggenmerg, waar het vervolgens naar de cellichamen wordt getransporteerd. Een dubbel-floxed inverted orientation (DIO) designerreceptor die uitsluitend wordt geactiveerd door designer drug (DREADD) virus wordt vervolgens geïnjecteerd in de somatomotorische cortex van de hersenen. Deze dubbele infectietechniek bevordert de expressie van de DREADDs alleen in de co-geïnfecteerde corticospinale tractus (CST) neuronen. De gelijktijdige co-injectie van de somatomotorische cortex en cervicale CST-terminals is dus een geldige methode voor het bestuderen van de chemogenetische modulatie van herstel na cervicale DWARSLAESIE-modellen bij neonatale ratten.

Introduction

Hoewel dwarslaesie een relatief zeldzame gebeurtenis is in de pediatrische populatie, is het bijzonder traumatisch en veroorzaakt het een permanente handicap die een enorme logistieke vooruitziende blik vereist. Bovendien wordt een hoger percentage pediatrische GCB’s geclassificeerd als cervicaal en compleet in vergelijking met de volwassen populatie ^1,2. Een kenmerk van zoogdiersoorten is dat pasgeborenen aanzienlijk beter herstellen van dwarslaesie dan volwassenen, en dit biedt een kans om de drijvende mechanismen voor herstel bij jongere populaties te beoordelen ^3,4,5. Desondanks zijn er minder multimodale studies die onderzoek naar pasgeborenen en babyknaagdieren aanpakken, deels vanwege de extra moeilijkheid om zich nauwkeurig te richten op geselecteerde populaties neuronen in de veel strakkere anatomische oriëntatiepunten van jongere dieren⁶. Dit artikel richt zich op de directe injectie van zeer efficiënte anterograde en retrograde adeno-geassocieerde vectoren in het ruggenmerg van de rat om belangrijke motorische paden te moduleren met de toepassing van Cre-afhankelijke-DREADDs, waardoor het bereik van multimodale regeneratiestudies wordt uitgebreid.

Virale vectoren zijn belangrijke biologische hulpmiddelen met een breed scala aan toepassingen, waaronder de introductie van genetisch materiaal om doelgenen te vervangen, groei-eiwitten te upreguleren en het anatomische landschap van het CZS^te traceren ^7,8,9. Veel van de anatomische details van spinale motorische routes zijn bestudeerd met behulp van klassieke tracers, d.w.z. gebiotinyleerd dextran amine. Hoewel traditionele tracers een belangrijke rol hebben gespeeld bij het blootleggen van neuroanatomie, zijn ze niet zonder hun nadelen: ze labelen willekeurig paden, zelfs als ze correct worden geïnjecteerd, en studies hebben aangetoond dat ze worden opgenomen door beschadigde axonen 10,11,12. Bijgevolg kan dit leiden tot onjuiste interpretaties in regeneratiestudies waarbij afgehakte axonen kunnen worden aangezien voor regenererende vezels.

De volgende methode maakt gebruik van het twee-virale vectorsysteem dat onlangs populair is geworden in modulatiestudies, met twee verschillende virale vectoren in twee afzonderlijke gebieden van hetzelfde neuron^13,14. De eerste is een vector die lokaal de cellichamen van projectieneuronen infecteert. De andere is een retrograde vector die wordt getransporteerd vanuit de axonterminals van de projectielonen (figuur 1). De retrograde vector draagt Cre-recombinase en de lokale vector bevat de “Cre-On” dubbel-gefloxeerde sequentie waarin een fluorescerend eiwit (mCherry) wordt gecodeerd. Het native transgen dat zowel hM3Dq als mCherry tot expressie brengt, is omgekeerd ten opzichte van de promotor en wordt geflankeerd door twee LoxP-sites (figuur 2). mCherry komt dus alleen tot expressie in de dubbel getransduceerde projectieneuronen waar Cre-recombinase een recombinatiegebeurtenis induceert tussen de LoxP-sites, waarbij de oriëntatie van het transgen in het juiste leesframe wordt omgedraaid en de expressie van zowel het DREADD- als het fluorescerende eiwit mogelijk wordt gemaakt. Zodra het virale transgen in de juiste oriëntatie is, en indien van toepassing, kunnen de DREADDs tijdelijk neuromodulatie induceren via een afzonderlijk geïnjecteerd ligand, d.w.z. clozapine-N-oxide. Het protocol is ontworpen om induceerbaar neuromodulatieonderzoek bij pasgeborenen te verifiëren, waarbij DREADDS worden geïnjecteerd om de CST’s selectief te moduleren. Het twee-virale systeem fungeert als een verzekeringspolis en zorgt ervoor dat elke DREADD-positieve cel traceerbaar is onder fluorescentie met hoge betrouwbaarheid om de injecties te valideren.

Deze methode helpt ook om de kloof in neonataal onderzoek te overbruggen. Pediatrische dwarslaesie presenteert zijn uitdagingen, en onderzoek dat regeneratie, kiemen of plasticiteit analyseert, moet de verschillen tussen pasgeborenen en volwassenen benadrukken 3,15,16,17. Door de chirurgische ingreep te optimaliseren en eerdere anatomische studies met Nissl-kleuring uit te voeren, werden de coördinaten voor zowel de craniale als de spinale injecties gevalideerd. Het doel was om een methode te bieden voor dubbele injecties in een neonatale rat met verhoogde getrouwheid en overlevingskansen.

Voor het huidige model werd de anterograde vector geïnjecteerd in de cellichamen van de somatomotorische cortex met behulp van bregma als referentie ^18,19. In termen van de spinale injecties werd de retrograde vector geïnjecteerd in laminae V-VII, waar de CST-axonterminals ^20,21 bevinden. Er zijn veel fundamentele vragen die ten grondslag liggen aan hoe bepaalde laesiemodellen jongere dieren anders beïnvloeden en hoe het daaropvolgende herstel afwijkt van een ouder dier. Deze studie toont een robuuste manier om cervicale verwondingen en het herstelvermogen van de voorpootfunctie bij neonatale knaagdieren te bestuderen. Daarentegen hebben de meeste eerdere studies betrekking op herstel voortbeweging na lumbale of thoracale verwondingen 5,22,23,24. Door de dubbel-virale vector te koppelen aan de nieuwe injectietechniek die hier wordt beschreven, helpt dit protocol bepaalde problemen (d.w.z. overlevingskansen) te verminderen die neonatale knaagdieronderzoeken kunnen teisteren. Deze methode is robuust, praktisch en veelzijdig: kleine variaties in de techniek maken het mogelijk om verschillende paden te richten, d.w.z. ventrale CST, dorsale CST en de opgaande dorsale paden.

Voor dit systeem wordt één lokaal werkend virus (bijv. AAV2) geïnjecteerd in het gebied van de neuronale cellichamen van belang. Een tweede retrograde getransporteerd virus dat de expressie van het lokale virus regelt, wordt geïnjecteerd op de axonterminals voor die neuronale populatie. Zo worden per definitie alleen corticospinale neuronen gelabeld. Het retroAAV-Cre-virus werd gekozen met een constitutief actieve CMV-promotor omdat het shuttleplasmide wordt gebruikt om verschillende AAV-serotypen te genereren voor Cre-afhankelijke expressie in verschillende celtypen. Voor corticale injecties werd gekozen voor AAV2 met het transgen aangedreven door de synapsine-1 promotor om elke expressie tot neuronen te beperken. Omdat het 2-virale systeem meer afhankelijk is van de oorsprong en beëindiging van de neuronale populatie van belang, kunnen verschillende promotors worden gebruikt, als ze de expressie van de genen van belang binnen de neuronale populatie van belang kunnen stimuleren. De exciterende neuronale promotor, CamKII, zou bijvoorbeeld kunnen worden vervangen door de synapsine-1. Naast het gebruik van deze AAV-serotypen kunnen retrograde transport naar onvolwassen en in veel mindere mate ook volwassen corticospinale motorneuronen worden bereikt met behulp van het hoge retrograde transporteerbare lentivirus (HiRet)²⁵. HiRet lentivirussen gebruiken een chimere Rabiës / VSV glycoproteïne om opname op de synaps te richten voor retrograde transport. In combinatie met een Tet-On promotor ondersteunt dit 2-virale systeem induceerbare expressie op een retrograde-afhankelijke manier ^26,27.

Retrograde virussen brengen vectoren in de synaptische ruimte van een doelneuron, waardoor het door het axon van die cel kan worden opgenomen en naar het cellichaam kan worden getransporteerd. Hoewel lentivirale vectoren eerder enorm succes hebben gehad en langetermijnexpressie bieden in gentherapiestudies, draaide deze methode om een paar eenvoudige redenen naar adeno-geassocieerde virale vectoren^26,28: AAV is zuiniger, vergelijkbaar effectief en vormt minder logistieke last, aangezien het een lagere bioveiligheidsniveauaanduiding heeft 29,30,31,32 . Hoewel AAV2, het meest gebruikte serotype, een robuuste transfectie van CST-axonen vertoont, kunnen toekomstige onderzoekers opmerken dat AAV1 enige veelzijdigheid biedt omdat het transynaptisch labelt, waardoor verschillende mogelijke iteraties in toekomstige studies naar voren komen³³. De laatste aanpassing is om het retrograde virus te coderen met Cre-recombinase, zodat meerdere anterogradevectoren tegelijkertijd kunnen worden geïntroduceerd, waardoor onnodig intern virusafval wordt verminderd en de kans wordt gemaximaliseerd dat de DREADDs zich in de juiste oriëntatie uitdrukken.

Uiteindelijk demonstreert dit protocol gelijktijdige injectie in de cortex en cervicale wervelkolom, specifiek gericht op respectievelijk de cellichamen en de axonterminals van het corticospinale kanaal. High-fidelity transfectie wordt gezien in de hersenschors en het ruggenmerg. Hoewel het beschreven protocol werd geperfectioneerd voor Sprague Dawley-ratten van 5 dagen oud, is het geschikt voor postnatale dagen 4-10 met kleine aanpassingen aan anesthesie en stereotactische coördinaten.

Protocol

Alle volgende chirurgische en dierverzorgingsprocedures zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van Temple University. Het beschreven protocol is een overlevingsoperatie en de dieren werden uiteindelijk geëuthanaseerd door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg natriumpentobarbital aan het einde van hun tijdspunten. 1. Pre-chirurgische voorbereiding Bereid ten minste twee getrokken glazen naalden voor virale injectie met behulp van 3,5 ml glazen capillaire pipetten…

Representative Results

Succesvolle injectie en transport van de virale vector moet resulteren in de transductie van unilaterale neuronen in het ruggenmerg en de motorische cortex. Figuur 4 toont de labeling van laag V CST-neuronen in de motorische cortex van een hersencoronasectie die Cre-afhankelijk-DREADDs-mCherry tot expressie brengt, gelijktijdig geïnjecteerd met een contralaterale wervelkolominjectie van rCre. De secties waren gekleurd met dsRed-antilichaam. <p class="jove_content" fo:keep-together.withi…

Discussion

Induceerbare genetische modulatie van hersenactiviteit met injecteerbare chemogenetische modifiers is een krachtig hulpmiddel bij het bestuderen van de verschillende mechanismen die ten grondslag liggen aan het herstel van dwarslaesie. De nauwkeurigheid van de targeting voor de induceerbare G-eiwit-gekoppelde receptoren (DREADDs) wordt verder verhoogd als men bedenkt dat fluorescentietracering de anatomische precisie in de histologie valideert. Dit artikel bespreekt een betrouwbare methode om te onderzoeken of het al dan…

Materials

#11 scalpel blades	Roboz	RS-9801-11	For use with the scalpel.
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic SC injection and fluid bolus
4.0 silk suture	Ethicon	771-683G	For skin closure
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation
Ketamine (Ketaset)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Lab Standard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	To hold the neonatal sterotaxic holder in place
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor		51615	For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)	Bryan Roth’s lab through Addgene		DREADD plasmid
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.
Liquid bandage	NewSkin	985838	To apply along sutures following surgery and encourage wound healing
Wire Cage Lamp	ZooMed	LF10EC	To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally