Apuntando al tracto corticoespinal en ratas neonatas con un vector viral doble utilizando cirugía combinada de cerebro y columna vertebral

Summary

Este protocolo demuestra un método novedoso para aplicar terapias génicas a subpoblaciones de células en ratas neonatas a edades postnatales de 5 a 10 días mediante la inyección de un modificador quimiogenético anterógrado en la corteza somatomotora y una recombinasa Cre retrógradamente transportable en la médula espinal cervical.

Abstract

Abordar con éxito los obstáculos que limitan la investigación en ratas neonatales es importante para estudiar las diferencias en los resultados observados en las lesiones pediátricas de la médula espinal (LME) en comparación con las LME adultas. Además, la introducción confiable de terapias en las células diana del sistema nervioso central (SNC) puede ser un desafío, y las imprecisiones pueden comprometer la eficacia del estudio o la terapia. Este protocolo combina la tecnología de vectores virales con una novedosa técnica quirúrgica para introducir con precisión terapias génicas en ratas neonatas en el día postnatal 5. Aquí, un virus diseñado para el transporte retrógrado (retroAAV2) de Cre se introduce en los terminales axónicos de las neuronas corticoespinales en la médula espinal, donde posteriormente se transporta a los cuerpos celulares. Luego se inyecta un receptor de diseño de orientación invertida (DIO) de doble floxed activado exclusivamente por el virus DREADD (DREADD) en la corteza somatomotora del cerebro. Esta técnica de doble infección promueve la expresión de los DREADDs solo en las neuronas coinfectadas del tracto corticoespinal (CST). Por lo tanto, la coinyección simultánea de la corteza somatomotora y los terminales CST cervicales es un método válido para estudiar la modulación quimiogenética de la recuperación siguiendo modelos de LME cervical en ratas neonatales.

Introduction

Si bien la LME es una ocurrencia relativamente rara en la población pediátrica, es particularmente traumática y causa una discapacidad permanente que requiere una inmensa previsión logística. Además, una mayor proporción de LME pediátricas se clasifica como cervical y completa en comparación con la población adulta ^1,2. Un sello distintivo entre las especies de mamíferos es que los recién nacidos se recuperan notablemente mejor de la LME que los adultos, y esto ofrece una oportunidad para evaluar los mecanismos impulsores de la recuperación en poblaciones más jóvenes ^3,4,5. A pesar de esto, hay menos estudios multimodales que aborden la investigación de roedores neonatos y lactantes, en parte debido a la dificultad adicional de dirigirse con precisión a poblaciones seleccionadas de neuronas en los puntos de referencia anatómicos mucho más estrechos de animales más jóvenes⁶. Este artículo se centra en la inyección directa de vectores adenoasociados anterógrados y retrógrados altamente eficientes en la médula espinal de rata para modular las principales vías motoras con la aplicación de Cre-dependiente-DREADDs, ampliando el alcance de los estudios de regeneración multimodal.

Los vectores virales son herramientas biológicas importantes con una amplia gama de aplicaciones, incluida la introducción de material genético para sustituir genes diana, regular al alza las proteínas de crecimiento y trazar el paisaje anatómico del SNC ^7,8,9. Muchos de los detalles anatómicos de las vías motoras espinales se han estudiado utilizando trazadores clásicos, es decir, amina dextrano biotinilada. Si bien los trazadores tradicionales han sido fundamentales para desenterrar la neuroanatomía, no están exentos de desventajas: etiquetan indiscriminadamente las vías incluso si se inyectan correctamente, y los estudios han encontrado que son absorbidos por axones dañados^10,11,12. En consecuencia, esto podría llevar a interpretaciones incorrectas en estudios de regeneración donde los axones cortados podrían confundirse con fibras regeneradoras.

El siguiente método utiliza el sistema de vectores bivirales recientemente popularizado en estudios de modulación, con dos vectores virales diferentes en dos áreas separadas de la misma neurona^13,14. El primero es un vector que infecta localmente los cuerpos celulares de las neuronas de proyección. El otro es un vector retrógrado que se transporta desde los terminales axónicos de las neuronas de proyección (Figura 1). El vector retrógrado lleva Cre recombinasa, y el vector local incorpora la secuencia de doble floxed “Cre-On” en la que se codifica una proteína fluorescente (mCherry). El transgén nativo que expresa tanto hM3Dq como mCherry está invertido en relación con el promotor y está flanqueado por dos sitios LoxP (Figura 2). Por lo tanto, mCherry solo se expresa en las neuronas de proyección doblemente transducidas donde Cre recombinase induce un evento de recombinación entre los sitios LoxP, volteando la orientación del transgén en el marco de lectura apropiado y permitiendo la expresión tanto del DREADD como de la proteína fluorescente. Una vez que el transgén viral está en la orientación correcta, y cuando corresponda, los DREADDs pueden inducir transitoriamente la neuromodulación a través de un ligando inyectado por separado, es decir, clozapina-N-óxido. El protocolo fue diseñado para autenticar la investigación de neuromodulación inducible en neonatos, en la que se inyectan DREADDS para modular los CST selectivamente. El sistema de dos virus actúa como una póliza de seguro, asegurando que cada célula DREADD positiva sea trazable bajo fluorescencia con alta fidelidad para validar las inyecciones.

Este método también ayuda a cerrar la brecha en la investigación neonatal. La LME pediátrica presenta sus desafíos, y la investigación que analiza la regeneración, la germinación o la plasticidad debe enfatizar las diferencias entre neonatos y adultos 3,15,16,17. Al optimizar el procedimiento quirúrgico y realizar estudios anatómicos previos con tinción de Nissl, se validaron las coordenadas para las inyecciones craneales y espinales. El objetivo era proporcionar un método para inyecciones duales en una rata neonatal con mayor fidelidad y capacidad de supervivencia.

Para el modelo actual, el vector anterógrado se inyectó en los cuerpos celulares de la corteza somatomotora utilizando bregma como referencia^18,19. En cuanto a las inyecciones espinales, el vector retrógrado fue inyectado en láminas V-VII, donde residen los terminales axónicos CST^20,21. Hay muchas preguntas fundamentales que subyacen a cómo ciertos modelos de lesiones afectan a los animales más jóvenes de manera diferente, y cómo la recuperación posterior diverge de un animal más viejo. Este estudio demuestra un medio robusto para estudiar las lesiones cervicales y la recuperabilidad de la función de las extremidades anteriores en roedores neonatales. En contraste, la mayoría de los estudios previos han abordado la locomoción de recuperación después de lesiones lumbares o torácicas 5,22,23,24. Al emparejar el vector doble viral con la nueva técnica de inyección descrita aquí, este protocolo ayuda a mitigar ciertos problemas (es decir, la capacidad de supervivencia) que pueden afectar las investigaciones de roedores neonatales. Este método es robusto, práctico y versátil: ligeras variaciones en la técnica permitirán dirigirse a diferentes vías, es decir, CST ventral, CST dorsal y las vías dorsales ascendentes.

Para este sistema, se inyecta un virus de acción local (por ejemplo, AAV2) en la región de los cuerpos celulares neuronales de interés. Un segundo virus transportado retrógradamente que controla la expresión del virus local se inyecta en los terminales axónicos para esa población neuronal. Por lo tanto, por definición, solo se etiquetan las neuronas corticoespinales. El virus retroAAV-Cre se eligió con un promotor CMV constitutivamente activo, ya que el plásmido lanzadera se utiliza para generar varios serotipos AAV para la expresión dependiente de Cre en varios tipos de células. Para las inyecciones corticales, se eligió AAV2 con el transgén impulsado por el promotor sinapsina-1 para limitar cualquier expresión a las neuronas. Debido a que el sistema 2-viral depende más del origen y la terminación de la población neuronal de interés, se podrían usar varios promotores diferentes, si pueden impulsar la expresión de los genes de interés dentro de la población neuronal de interés. Por ejemplo, el promotor neuronal excitatorio, CamKII, podría ser sustituido por la sinapsina-1. Además del uso de estos serotipos AAV, el transporte retrógrado en neuronas motoras corticoespinales adultas inmaduras y, en mucho menor medida, también se puede lograr utilizando el lentivirus transportable retrógrado (HiRet)²⁵. Los lentivirus HiRet utilizan una glicoproteína quimérica de la rabia / VSV para apuntar a la absorción en la sinapsis para el transporte retrógrado. Combinado con un promotor Tet-On, este sistema 2-viral apoya la expresión inducible de una manera retrógrada dependiente^26,27.

Los virus retrógrados insertan vectores en el espacio sináptico de una neurona objetivo, lo que permite que sea absorbida por el axón de esa célula y transportada al cuerpo celular. Si bien los vectores lentivirales han tenido un éxito tremendo anteriormente, proporcionando expresión a largo plazo en estudios de terapia génica, este método giró hacia vectores virales adenoasociados por algunas razones simples^26,28: AAV es más económico, igualmente efectivo y presenta menos carga logística, dado que tiene una designación de nivel de bioseguridad más bajo 29,30,31,32 . Mientras que AAV2, el serotipo más utilizado, demuestra una transfección robusta de axones CST, futuros investigadores pueden notar que AAV1 ofrece cierta versatilidad ya que etiqueta transinápticamente, presentando así varias iteraciones posibles en estudios futuros³³. La adaptación final es codificar el virus retrógrado con Cre-recombinasa para que se puedan introducir múltiples vectores anterógrados simultáneamente, reduciendo así el desperdicio innecesario de virus internos y maximizando la probabilidad de que los DREADDs se expresen en la orientación correcta.

En última instancia, este protocolo demuestra la inyección simultánea en la corteza y la columna cervical, dirigida específicamente a los cuerpos celulares y las terminales axónicas del tracto corticoespinal, respectivamente. La transfección de alta fidelidad se observa en la corteza cerebral y la médula espinal. Si bien el protocolo descrito se perfeccionó para ratas Sprague Dawley de 5 días de edad, es adecuado para los días postnatales 4-10 con ajustes menores a la anestesia y las coordenadas estereotácticas.

Protocol

Todos los siguientes procedimientos quirúrgicos y de cuidado de animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Temple. El protocolo descrito es una cirugía de supervivencia, y los animales fueron finalmente sacrificados por inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al finalizar sus puntos temporales. 1. Preparación prequirúrgica Prepare al menos dos agujas de vidrio extraídas para la inyección viral con pipeta…

Representative Results

La inyección y el transporte exitosos del vector viral deben resultar en la transducción de neuronas unilaterales en la médula espinal y la corteza motora. La Figura 4 demuestra el etiquetado de las neuronas CST de capa V en la corteza motora de una sección coronal cerebral que expresa Cre-dependiente-DREADDs-mCherry co-inyectado con una inyección contralateral de rCre en la columna vertebral. Las secciones fueron teñidas con el anticuerpo dsRed. <p class="jove_content" fo:keep-tog…

Discussion

La modulación genética inducible de la actividad cerebral con modificadores quimiogenéticos inyectables es una herramienta poderosa para estudiar los diversos mecanismos que subyacen a la recuperación de la LME. La precisión de la orientación para los receptores inducibles acoplados a proteínas G (DREADDs) aumenta aún más cuando se considera que el rastreo de fluorescencia valida la precisión anatómica en histología. Este artículo discute un método confiable para explorar si la inhibición o estimulación d…

Materials

#11 scalpel blades	Roboz	RS-9801-11	For use with the scalpel.
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic SC injection and fluid bolus
4.0 silk suture	Ethicon	771-683G	For skin closure
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation
Ketamine (Ketaset)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Lab Standard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	To hold the neonatal sterotaxic holder in place
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor		51615	For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)	Bryan Roth’s lab through Addgene		DREADD plasmid
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.
Liquid bandage	NewSkin	985838	To apply along sutures following surgery and encourage wound healing
Wire Cage Lamp	ZooMed	LF10EC	To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally