Visando o trato corticoespinhal em ratos neonatais com um vetor duplo-viral usando cirurgia combinada de cérebro e coluna vertebral

Summary

Este protocolo demonstra um novo método para a aplicação de terapias genéticas a subpopulações de células em ratos neonatais em idades pós-natais de 5 a 10 dias, injetando um modificador quimiogenético anterógrado no córtex somatomotor e uma Cre recombinase retrógrada transportável na medula espinhal cervical.

Abstract

Enfrentar com sucesso os obstáculos que restringem a pesquisa em ratos neonatais é importante para estudar as diferenças nos resultados observados nas lesões da medula espinhal pediátrica (LME) em comparação com as ISCs adultas. Além disso, a introdução confiável de terapias nas células-alvo do sistema nervoso central (SNC) pode ser um desafio, e imprecisões podem comprometer a eficácia do estudo ou da terapia. Este protocolo combina a tecnologia de vetores virais com uma nova técnica cirúrgica para introduzir com precisão terapias genéticas em ratos neonatais no 5º dia pós-natal. Aqui, um vírus projetado para o transporte retrógrado (retroAAV2) de Cre é introduzido nos terminais axônicos dos neurônios corticoespinhais na medula espinhal, onde é posteriormente transportado para os corpos celulares. Um receptor projetista de orientação invertida (DIO) de dupla floxe exclusivamente ativado pelo vírus da droga (s) designer (DREADD) é então injetado no córtex somatomotor do cérebro. Esta técnica de dupla infecção promove a expressão dos DREADDs apenas nos neurônios do trato corticoespinhal (TSC) co-infectados. Assim, a co-injeção simultânea do córtex somatomotor e dos terminais CST cervical é um método válido para estudar a modulação quimiogenética da recuperação seguindo modelos de LM cervical em ratos neonatais.

Introduction

Embora a LM seja uma ocorrência relativamente rara na população pediátrica, é particularmente traumática e causa uma incapacidade permanente que requer imensa previsão logística. Além disso, uma maior proporção de LME pediátrica é classificada como cervical e completa em comparação com a população adulta ^1,2. Uma característica das espécies de mamíferos é que os neonatos se recuperam notavelmente melhor da LM do que os adultos, o que oferece uma oportunidade para avaliar os mecanismos determinantes para a recuperação em populações mais jovens ^3,4,5. Apesar disso, há menos estudos multimodais que abordam a pesquisa de recém-nascidos e roedores infantis, em parte devido à dificuldade adicional de direcionar com precisão populações selecionadas de neurônios nos marcos anatômicos muito mais apertados de animais mais jovens⁶. Este artigo enfoca a injeção direta de vetores adenoassociados ânterogrados e retrógrados altamente eficientes na medula espinhal de ratos para modular as principais vias motoras com a aplicação de DREADDs dependentes de Cre, expandindo o alcance de estudos de regeneração multimodal.

Os vetores virais são importantes ferramentas biológicas com uma amplitude de aplicações, incluindo a introdução de material genético para substituir genes-alvo, regular positivamente as proteínas de crescimento e traçar a paisagem anatômica do SNC ^7,8,9. Muitos dos detalhes anatômicos das vias motoras espinhais têm sido estudados usando traçadores clássicos, ou seja, a amina dextrana biotinilada. Embora os traçadores tradicionais tenham sido fundamentais para a descoberta da neuroanatomia, eles não estão isentos de desvantagens: eles rotulam indiscriminadamente as vias, mesmo que corretamente injetados, e estudos descobriram que eles são absorvidos por axônios danificados^10,11,12. Consequentemente, isso poderia levar a interpretações incorretas em estudos de regeneração, onde axônios cortados poderiam ser confundidos com fibras regeneradoras.

O método a seguir utiliza o sistema de vetores bivirais recentemente popularizado em estudos de modulação, com dois vetores virais diferentes em duas áreas separadas do mesmo neurônio^13,14. O primeiro é um vetor que infecta localmente os corpos celulares dos neurônios de projeção. O outro é um vetor retrógrado sendo transportado dos terminais axônicos dos neurônios de projeção (Figura 1). O vetor retrógrado carrega Cre recombinase, e o vetor local incorpora a sequência de floxe duplo “Cre-On” na qual uma proteína fluorescente (mCherry) é codificada. O transgene nativo que expressa tanto hM3Dq quanto mCherry é invertido em relação ao promotor e é flanqueado por dois sítios LoxP (Figura 2). Assim, o mCherry só é expresso nos neurônios de projeção duplamente transduzidos onde a Cre recombinase induz um evento de recombinação entre os sítios LoxP, invertendo a orientação do transgene para o quadro de leitura apropriado e permitindo a expressão do DREADD e da proteína fluorescente. Uma vez que o transgene viral esteja na orientação correta, e quando aplicável, os DREADDs podem induzir transitoriamente a neuromodulação através de um ligante injetado separadamente, ou seja, clozapina-N-óxido. O protocolo foi projetado para autenticar pesquisas de neuromodulação induzíveis em neonatos, em que os DREADDS são injetados para modular os CSTs seletivamente. O sistema de dois vírus atua como uma apólice de seguro, garantindo que cada célula positiva para DREADD seja rastreável sob fluorescência com alta fidelidade para validar as injeções.

Este método também ajuda a preencher a lacuna na pesquisa neonatal. A LM pediátrica apresenta seus desafios, e pesquisas que analisem a regeneração, a brotação ou a plasticidade devem enfatizar as diferenças entre neonatos e adultos 3,15,16,17. Otimizando o procedimento cirúrgico e realizando estudos anatômicos prévios com coloração de Nissl, as coordenadas para as injeções cranianas e espinhais foram validadas. O objetivo era fornecer um método para injeções duplas em um rato neonatal com maior fidelidade e capacidade de sobrevivência.

Para o modelo atual, o vetor anterógrado foi injetado nos corpos celulares do córtex somatomotor utilizando o bregma como referência^18,19. Em relação às injeções espinhais, o vetor retrógrado foi injetado nas lâminas V-VII, onde residem os terminais axônicos CST^20,21. Existem muitas questões fundamentais subjacentes a como certos modelos de lesões afetam animais mais jovens de forma diferente e como a recuperação subsequente diverge de um animal mais velho. Este estudo demonstra um meio robusto de estudar lesões cervicais e a recuperabilidade da função dos membros anteriores em roedores neonatais. Em contrapartida, a maioria dos estudos anteriores abordou a locomoção da recuperação após lesões lombares ou torácicas 5,22,23,24. Ao emparelhar o vetor duplo-viral com a nova técnica de injeção descrita aqui, este protocolo ajuda a mitigar certos problemas (ou seja, a capacidade de sobrevivência) que podem atormentar as investigações de roedores neonatais. Este método é robusto, prático e versátil: pequenas variações na técnica permitirão atingir diferentes vias, ou seja, TSC ventral, TSC dorsal e vias dorsais ascendentes.

Para este sistema, um vírus de ação local (por exemplo, AAV2) é injetado na região dos corpos celulares neuronais de interesse. Um segundo vírus transportado retrógrado que controla a expressão do vírus local é injetado nos terminais axônicos para essa população neuronal. Assim, por definição, apenas os neurônios corticoespinhais são rotulados. O vírus retroAAV-Cre foi escolhido com um promotor de CMV constitutivamente ativo, pois o plasmídeo shuttle é usado para gerar vários sorotipos de AAV para expressão dependente de Cre em vários tipos de células. Para injeções corticais, o AAV2 foi escolhido com o transgene acionado pelo promotor de sinapsina-1 para limitar qualquer expressão aos neurônios. Como o sistema 2-viral depende mais da origem e término da população neuronal de interesse, vários promotores diferentes poderiam ser usados, se eles puderem impulsionar a expressão dos genes de interesse dentro da população neuronal de interesse. Por exemplo, o promotor neuronal excitatório, CamKII, poderia ser substituído pela sinapsina-1. Além do uso desses sorotipos de AAV, o transporte retrógrado para imaturos e, em muito menor grau, neurônios motores corticoespinhais adultos também pode ser alcançado usando o lentivírus transportável retrógrado alto (HiRet)²⁵. Os lentivírus HiRet usam uma glicoproteína quimérica de raiva/VSV para direcionar a captação na sinapse para o transporte retrógrado. Combinado com um promotor Tet-On, este sistema 2-viral suporta a expressão induzível de forma retrógrada-dependente^26,27.

Os vírus retrógrados inserem vetores no espaço sináptico de um neurônio-alvo, permitindo que ele seja absorvido pelo axônio dessa célula e transportado para o corpo celular. Embora os vetores lentivirais tenham tido anteriormente um tremendo sucesso, proporcionando expressão a longo prazo em estudos de terapia gênica, esse método girou em direção aos vetores virais adenoassociados por algumas razões simples^26,28: o AAV é mais econômico, igualmente eficaz e apresenta menos carga logística, uma vez que possui uma designação de nível de biossegurança mais baixa 29,30,31,32 . Enquanto o AAV2, o sorotipo mais utilizado, demonstra transfecção robusta de axônios CST, futuros pesquisadores podem notar que o AAV1 oferece alguma versatilidade ao rotular transinapticamente, apresentando assim várias iterações possíveis em estudos futuros³³. A adaptação final é codificar o vírus retrógrado com Cre-recombinase para que múltiplos vetores anterógrados possam ser introduzidos simultaneamente, reduzindo assim o desperdício desnecessário de vírus internos e maximizando a probabilidade de os DREADDs se expressarem na orientação correta.

Em última análise, este protocolo demonstra a injeção simultânea no córtex e na coluna cervical, visando especificamente os corpos celulares e os terminais axônicos do trato corticoespinhal, respectivamente. A transfecção de alta fidelidade é observada no córtex cerebral e na medula espinhal. Embora o protocolo descrito tenha sido aperfeiçoado para ratos Sprague Dawley com 5 dias de idade, é adequado para os dias pós-natais 4-10 com pequenos ajustes na anestesia e coordenadas estereotáxicas.

Protocol

Todos os seguintes procedimentos cirúrgicos e de cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Temple University. O protocolo descrito é uma cirurgia de sobrevida, e os animais foram eventualmente eutanasiados por injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico ao término de seus períodos. 1. Preparação pré-cirúrgica Preparar pelo menos duas agulhas de vidro puxadas para injeção viral usando pipetas capilares de vidro de 3…

Representative Results

A injeção e o transporte bem-sucedidos do vetor viral devem resultar na transdução de neurônios unilaterais na medula espinhal e no córtex motor. A Figura 4 demonstra a marcação de neurônios CST da camada V no córtex motor de uma seção coronal cerebral expressando Cre-dependentes-DREADDs-mCherry co-injetados com uma injeção contralateral de rCre na coluna. Os cortes foram corados com anticorpo dsRed. <img alt="Figure …

Discussion

A modulação genética induzível da atividade cerebral com modificadores quimiogenéticos injetáveis é uma ferramenta poderosa no estudo dos vários mecanismos subjacentes à recuperação da LME. A precisão do direcionamento para os receptores acoplados à proteína G induzíveis (DREADDs) é ainda maior quando se considera que o traçado por fluorescência valida a precisão anatômica na histologia. Este artigo discute um método confiável para explorar se a inibição ou estimulação de vias neuronais selecion…

Materials

#11 scalpel blades	Roboz	RS-9801-11	For use with the scalpel.
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic SC injection and fluid bolus
4.0 silk suture	Ethicon	771-683G	For skin closure
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation
Ketamine (Ketaset)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Lab Standard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	To hold the neonatal sterotaxic holder in place
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor		51615	For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)	Bryan Roth’s lab through Addgene		DREADD plasmid
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.
Liquid bandage	NewSkin	985838	To apply along sutures following surgery and encourage wound healing
Wire Cage Lamp	ZooMed	LF10EC	To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally