Targeting des kortikospinalen Trakts bei neonatalen Ratten mit einem doppelviralen Vektor mittels kombinierter Gehirn- und Wirbelsäulenchirurgie

Summary

Dieses Protokoll demonstriert eine neuartige Methode zur Anwendung von Gentherapien auf Subpopulationen von Zellen bei neonatalen Ratten im postnatalen Alter von 5-10 Tagen durch Injektion eines anterograden chemogenetischen Modifikators in den somatomotorischen Kortex und einer retrograden transportablen Cre-Rekombinase in das zervikale Rückenmark.

Abstract

Die erfolgreiche Überwindung der Hindernisse, die die Forschung an neonatalen Ratten behindern, ist wichtig, um die Unterschiede in den Ergebnissen bei pädiatrischen Rückenmarksverletzungen (SCIs) im Vergleich zu erwachsenen SCIs zu untersuchen. Darüber hinaus kann die zuverlässige Einführung von Therapien in die Zielzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) eine Herausforderung darstellen, und Ungenauigkeiten können die Wirksamkeit der Studie oder Therapie beeinträchtigen. Dieses Protokoll kombiniert die virale Vektortechnologie mit einer neuartigen chirurgischen Technik, um Gentherapien bei neonatalen Ratten am postnatalen Tag 5 präzise einzuführen. Hier wird ein Virus, das für den retrograden Transport (retroAAV2) von Cre entwickelt wurde, an den Axonendigungen kortikospinaler Neuronen im Rückenmark eingeschleust, wo es anschließend zu den Zellkörpern transportiert wird. Ein doppelt gefloxter Designer-Rezeptor mit umgekehrter Orientierung (DIO), der ausschließlich durch das Designer-Drug-Virus (DREADD) aktiviert wird, wird dann in den somatomotorischen Kortex des Gehirns injiziert. Diese Doppelinfektionstechnik fördert die Expression der DREADDs nur in den koinfizierten Neuronen des kortikospinalen Trakts (CST). Daher ist die gleichzeitige Co-Injektion des somatomotorischen Kortex und der zervikalen CST-Terminals eine gültige Methode zur Untersuchung der chemogenetischen Modulation der Genesung nach zervikalen SCI-Modellen bei neonatalen Ratten.

Introduction

Während Rückenmarksverletzung in der pädiatrischen Bevölkerung relativ selten vorkommt, ist sie besonders traumatisch und verursacht eine dauerhafte Behinderung, die eine immense logistische Voraussicht erfordert. Darüber hinaus wird ein höherer Anteil pädiatrischer Rückenmarksverletzungen als zervikal und vollständig eingestuft als in der erwachsenen Bevölkerung ^1,2. Ein Kennzeichen aller Säugetierarten ist, dass sich Neugeborene deutlich besser von einer Rückenmarksverletzung erholen als erwachsene Tiere, und dies bietet die Möglichkeit, die treibenden Mechanismen für die Erholung in jüngeren Populationen zu bewerten ^3,4,5. Trotzdem gibt es weniger multimodale Studien, die sich mit der Erforschung von Neugeborenen und Säuglingsnagetieren befassen, was zum Teil auf die zusätzliche Schwierigkeit zurückzuführen ist, ausgewählte Populationen von Neuronen in den viel engeren anatomischen Orientierungspunkten jüngerer Tiere genau anzuvisieren⁶. Dieser Artikel konzentriert sich auf die direkte Injektion von hocheffizienten anterograden und retrograden Adeno-assoziierten Vektoren in das Rückenmark der Ratte, um wichtige motorische Bahnen mit der Anwendung von Cre-abhängigen DREADDs zu modulieren, wodurch die Reichweite multimodaler Regenerationsstudien erweitert wird.

Virale Vektoren sind wichtige biologische Werkzeuge mit einer breiten Palette von Anwendungen, einschließlich der Einführung von genetischem Material, um Zielgene zu ersetzen, Wachstumsproteine hochzuregulieren und die anatomische Landschaft des ZNS ^7,8,9 zu verfolgen. Viele der anatomischen Details der motorischen Bahnen der Wirbelsäule wurden mit klassischen Tracer, d.h. biotinyliertem Dextranamin, untersucht. Während traditionelle Tracer maßgeblich zur Aufdeckung der Neuroanatomie beigetragen haben, sind sie nicht ohne Nachteile: Sie markieren wahllos Signalwege, selbst wenn sie korrekt injiziert werden, und Studien haben gezeigt, dass sie von beschädigten Axonen aufgenommen werden^10,11,12. Folglich könnte dies zu falschen Interpretationen in Regenerationsstudien führen, bei denen abgetrennte Axone mit regenerierenden Fasern verwechselt werden könnten.

Die folgende Methode nutzt das Zwei-Virus-Vektorsystem, das kürzlich in Modulationsstudien populär gemacht wurde, mit zwei verschiedenen viralen Vektoren in zwei getrennten Bereichen desselben Neurons^13,14. Der erste ist ein Vektor, der die Zellkörper von Projektionsneuronen lokal infiziert. Der andere ist ein retrograder Vektor, der von den Axonendigungen der Projektionsneuronen transportiert wird (Abbildung 1). Der retrograde Vektor trägt Cre-Rekombinase, und der lokale Vektor enthält die “Cre-On”-Doppel-Flox-Sequenz, in der ein fluoreszierendes Protein (mCherry) kodiert ist. Das native Transgen, das sowohl hM3Dq als auch mCherry exprimiert, ist relativ zum Promotor invertiert und wird von zwei LoxP-Stellen flankiert (Abbildung 2). Daher wird mCherry nur in den doppelt transduzierten Projektionsneuronen exprimiert, bei denen die Cre-Rekombinase ein Rekombinationsereignis zwischen den LoxP-Stellen induziert, die Orientierung des Transgens in den entsprechenden Leserahmen umdreht und die Expression sowohl des DREADD als auch des fluoreszierenden Proteins ermöglicht. Sobald sich das virale Transgen in der richtigen Ausrichtung befindet, können die DREADDs vorübergehend eine Neuromodulation durch einen separat injizierten Liganden, d.h. Clozapin-N-Oxid, induzieren. Das Protokoll wurde entwickelt, um induzierbare Neuromodulationsforschung bei Neugeborenen zu authentifizieren, wobei DREADDS injiziert werden, um die CSTs selektiv zu modulieren. Das Zwei-Virus-System fungiert als Versicherungspolice und stellt sicher, dass jede DREADD-positive Zelle unter Fluoreszenz mit hoher Genauigkeit zurückverfolgt werden kann, um die Injektionen zu validieren.

Diese Methode hilft auch, die Lücke in der Neugeborenenforschung zu schließen. Pädiatrische Rückenmarksverletzung stellt ihre Herausforderungen dar, und Forschung, die Regeneration, Keimung oder Plastizität analysiert, sollte die Unterschiede zwischen Neugeborenen und Erwachsenen betonen 3,15,16,17. Durch die Optimierung des chirurgischen Eingriffs und die Durchführung früherer anatomischer Studien mit Nissl-Färbung wurden die Koordinaten sowohl für die kranialen als auch für die spinalen Injektionen validiert. Ziel war es, eine Methode zur doppelten Injektion in eine neugeborene Ratte mit erhöhter Genauigkeit und Überlebensfähigkeit bereitzustellen.

Für das aktuelle Modell wurde der anterograde Vektor in die Zellkörper des somatomotorischen Kortex injiziert, wobei Bregma als Referenz^18,19 verwendet wurde. In Bezug auf die Wirbelsäuleninjektionen wurde der retrograde Vektor in Laminae V-VII injiziert, wo sich die CST-Axonendigungen^{befinden 20,21}. Es gibt viele grundlegende Fragen, die zugrunde liegen, wie bestimmte Läsionsmodelle jüngere Tiere unterschiedlich beeinflussen und wie die anschließende Erholung von einem älteren Tier abweicht. Diese Studie zeigt ein robustes Mittel zur Untersuchung von Gebärmutterhalsverletzungen und der Wiederherstellbarkeit der Funktion der Vordergliedmaßen bei neonatalen Nagetieren. Im Gegensatz dazu befasste sich die Mehrzahl der bisherigen Studien mit der Fortbewegung der Erholung nach Lenden- oder Thoraxverletzungen ^5,22,23,24. Durch die Paarung des doppelviralen Vektors mit der hier beschriebenen neuartigen Injektionstechnik trägt dieses Protokoll dazu bei, bestimmte Probleme (z. B. die Überlebensfähigkeit) zu mildern, die die Untersuchung von Nagetieren bei Neugeborenen beeinträchtigen können. Diese Methode ist robust, praktisch und vielseitig: Leichte Variationen in der Technik ermöglichen es, verschiedene Bahnen anzuvisieren, d.h. ventrale CST, dorsale CST und die aufsteigenden dorsalen Pfade.

Für dieses System wird ein lokal wirkendes Virus (z.B. AAV2) in die Region der interessierenden neuronalen Zellkörper injiziert. Ein zweites retrograd transportiertes Virus, das die Expression des lokalen Virus steuert, wird an den Axon-Terminals für diese neuronale Population injiziert. Daher werden definitionsgemäß nur kortikospinale Neuronen markiert. Das retroAAV-Cre-Virus wurde mit einem konstitutiv aktiven CMV-Promotor ausgewählt, da das Shuttle-Plasmid verwendet wird, um mehrere AAV-Serotypen für die Cre-abhängige Expression in verschiedenen Zelltypen zu erzeugen. Für kortikale Injektionen wurde AAV2 mit dem Transgen gewählt, das vom Synapsin-1-Promotor angetrieben wird, um die Expression auf Neuronen zu beschränken. Da das 2-virale System mehr auf den Ursprung und die Beendigung der interessierenden neuronalen Population angewiesen ist, könnten mehrere verschiedene Promotoren verwendet werden, wenn sie die Expression der interessierenden Gene innerhalb der interessierenden neuronalen Population steuern können. Zum Beispiel könnte der exzitatorische neuronale Promotor CamKII das Synapsin-1 ersetzen. Neben der Verwendung dieser AAV-Serotypen kann auch ein retrograder Transport in unreife und in viel geringerem Maße adulte kortikospinale Motoneuronen mit dem hochretrograden transportablen Lentivirus (HiRet)²⁵ erreicht werden. HiRet-Lentiviren verwenden ein chimäres Tollwut/VSV-Glykoprotein, um die Aufnahme an der Synapse für den retrograden Transport zu steuern. In Kombination mit einem Tet-On-Promotor unterstützt dieses 2-virale System die induzierbare Expression in retrograder Abhängigkeit^26,27.

Retrograde Viren schleusen Vektoren in den synaptischen Raum eines Zielneurons ein, so dass es vom Axon dieser Zelle aufgenommen und in den Zellkörper transportiert werden kann. Während lentivirale Vektoren in der Vergangenheit enormen Erfolg hatten und eine langfristige Expression in Gentherapiestudien ermöglichten, konzentrierte sich diese Methode aus einigen einfachen Gründen auf Adeno-assoziierte virale Vektoren^26,28: AAV ist wirtschaftlicher, ähnlich effektiv und stellt einen geringeren logistischen Aufwand dar, da es eine niedrigere Biosicherheitsstufe aufweist 29,30,31,32 . Während AAV2, der am häufigsten verwendete Serotyp, eine robuste Transfektion von CST-Axonen zeigt, könnten zukünftige Forscher feststellen, dass AAV1 eine gewisse Vielseitigkeit bietet, da es transynaptisch markiert und somit mehrere mögliche Iterationen in zukünftigen Studien hervorbringt³³. Die letzte Anpassung besteht darin, das retrograde Virus mit Cre-Rekombinase zu kodieren, so dass mehrere anterograde Vektoren gleichzeitig eingeführt werden können, wodurch unnötiger interner Virusabfall reduziert und die Wahrscheinlichkeit maximiert wird, dass die DREADDs in der richtigen Ausrichtung exprimieren.

Letztendlich zeigt dieses Protokoll die gleichzeitige Injektion in den Kortex und die Halswirbelsäule, die spezifisch auf die Zellkörper bzw. die Axonendigungen des Kortikospinaltraktes abzielt. High-Fidelity-Transfektion wird in der Großhirnrinde und im Rückenmark beobachtet. Während das beschriebene Protokoll für Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 5 Tagen perfektioniert wurde, ist es für die postnatalen Tage 4-10 mit geringfügigen Anpassungen der Anästhesie und der stereotaktischen Koordinaten geeignet.

Protocol

Alle folgenden chirurgischen und tierpflegerischen Verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der Temple University genehmigt. Das beschriebene Protokoll ist eine Überlebensoperation, und die Tiere wurden schließlich durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Natriumpentobarbital nach Ablauf ihrer Zeitpunkte eingeschläfert. 1. Präoperative Vorbereitung Bereiten Sie mindestens zwei gezogene Glasnadeln für die Virusinjektion mit 3,5 nL Glaskapillarpipetten vor. eine Na…

Representative Results

Eine erfolgreiche Injektion und ein erfolgreicher Transport des viralen Vektors sollten zur Transduktion von einseitigen Neuronen im Rückenmark und im motorischen Kortex führen. Abbildung 4 zeigt die Markierung von CST-Neuronen der Schicht V im motorischen Kortex eines koronalen Hirnschnitts, der Cre-abhängige-DREADDs-mCherry exprimiert, die zusammen mit einer kontralateralen Wirbelsäuleninjektion von rCre injiziert wurden. Die Schnitte wurden mit dsRed-Antikörpern gefärbt. <p clas…

Discussion

Die induzierbare genetische Modulation der Gehirnaktivität mit injizierbaren chemogenetischen Modifikatoren ist ein leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung der verschiedenen Mechanismen, die der Genesung von Rückenmarksverletzungen zugrunde liegen. Die Genauigkeit des Targetings für die induzierbaren G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (DREADDs) wird weiter erhöht, wenn man bedenkt, dass die Fluoreszenzverfolgung die anatomische Präzision in der Histologie validiert. Dieser Artikel diskutiert eine zuverlässige…

Materials

#11 scalpel blades	Roboz	RS-9801-11	For use with the scalpel.
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic SC injection and fluid bolus
4.0 silk suture	Ethicon	771-683G	For skin closure
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation
Ketamine (Ketaset)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Lab Standard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	To hold the neonatal sterotaxic holder in place
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor		51615	For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)	Bryan Roth’s lab through Addgene		DREADD plasmid
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.
Liquid bandage	NewSkin	985838	To apply along sutures following surgery and encourage wound healing
Wire Cage Lamp	ZooMed	LF10EC	To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally