Targeting del tratto corticospinale nei ratti neonatali con un vettore doppio virale utilizzando la chirurgia combinata del cervello e della colonna vertebrale

Summary

Questo protocollo dimostra un nuovo metodo per applicare terapie geniche a sottopopolazioni di cellule in ratti neonatali in età postnatale 5-10 giorni iniettando un modificatore chemiogenetico anterogrado nella corteccia somatomotoria e una Cre ricombinasi retrogradamente trasportabile nel midollo spinale cervicale.

Abstract

Affrontare con successo gli ostacoli che limitano la ricerca sui ratti neonatali è importante per studiare le differenze nei risultati osservati nelle lesioni del midollo spinale pediatrico (SCI) rispetto alle SCI adulte. Inoltre, l’introduzione affidabile di terapie nelle cellule bersaglio del sistema nervoso centrale (SNC) può essere difficile e le imprecisioni possono compromettere l’efficacia dello studio o della terapia. Questo protocollo combina la tecnologia dei vettori virali con una nuova tecnica chirurgica per introdurre accuratamente le terapie geniche nei ratti neonatali al giorno 5 postnatale. Qui, un virus progettato per il trasporto retrogrado (retroAAV2) di Cre viene introdotto ai terminali assoni dei neuroni corticospinali nel midollo spinale, dove viene successivamente trasportato ai corpi cellulari. Un recettore designer a doppio floxed orientamento-invertito (DIO) attivato esclusivamente dal virus dei farmaci designer (DREADD) viene quindi iniettato nella corteccia somatomotoria del cervello. Questa tecnica di doppia infezione promuove l’espressione dei DREADD solo nei neuroni del tratto corticospinale co-infetti (CST). Pertanto, la co-iniezione simultanea della corteccia somatomotoria e dei terminali CST cervicali è un metodo valido per studiare la modulazione chemiogenetica del recupero seguendo modelli di SCI cervicale nei ratti neonatali.

Introduction

Mentre la SCI è un evento relativamente raro nella popolazione pediatrica, è particolarmente traumatica e causa una disabilità permanente che richiede un’immensa lungimiranza logistica. Inoltre, una percentuale maggiore di SCI pediatrici è classificata come cervicale e completa rispetto alla popolazione adulta ^1,2. Un segno distintivo tra le specie di mammiferi è che i neonati guariscono notevolmente meglio dalla SCI rispetto agli adulti, e questo offre l’opportunità di valutare i meccanismi trainanti per il recupero nelle popolazioni più giovani ^3,4,5. Nonostante ciò, ci sono meno studi multimodali che affrontano la ricerca sui neonati e sui roditori infantili, in parte a causa della difficoltà aggiuntiva di indirizzare con precisione popolazioni selezionate di neuroni nei punti di riferimento anatomici molto più stretti degli animali più giovani⁶. Questo articolo si concentra sull’iniezione diretta di vettori adeno-associati anterogradi e retrogradi altamente efficienti nel midollo spinale del ratto per modulare le principali vie motorie con l’applicazione di Cre-dipendenti-DREADD, espandendo la portata degli studi di rigenerazione multimodale.

I vettori virali sono importanti strumenti biologici con un’ampia gamma di applicazioni, tra cui l’introduzione di materiale genetico per sostituire i geni bersaglio, sovraregolare le proteine della crescita e tracciare il paesaggio anatomico del SNC ^7,8,9. Molti dei dettagli anatomici delle vie motorie spinali sono stati studiati utilizzando traccianti classici, cioè ammina destrana biotinilata. Mentre i traccianti tradizionali sono stati determinanti nel portare alla luce la neuroanatomia, non sono privi di svantaggi: etichettano indiscriminatamente i percorsi anche se iniettati correttamente, e gli studi hanno scoperto che sono assorbiti dagli assoni danneggiati^10,11,12. Di conseguenza, ciò potrebbe portare a interpretazioni errate negli studi di rigenerazione in cui gli assoni recisi potrebbero essere scambiati per fibre rigeneranti.

Il seguente metodo utilizza il sistema di vettori bivirali recentemente reso popolare negli studi di modulazione, con due diversi vettori virali in due aree separate dello stesso neurone^13,14. Il primo è un vettore che infetta localmente i corpi cellulari dei neuroni di proiezione. L’altro è un vettore retrogrado trasportato dai terminali assoni dei neuroni di proiezione (Figura 1). Il vettore retrogrado porta Cre ricombinasi, e il vettore locale incorpora la sequenza “Cre-On” a doppio floxed in cui è codificata una proteina fluorescente (mCherry). Il transgene nativo che esprime sia hM3Dq che mCherry è invertito rispetto al promotore ed è affiancato da due siti LoxP (Figura 2). Pertanto, mCherry è espresso solo nei neuroni di proiezione doppiamente trasdotti in cui Cre ricombinasi induce un evento di ricombinazione tra i siti LoxP, capovolgendo l’orientamento del transgene nel frame di lettura appropriato e consentendo l’espressione sia del DREADD che della proteina fluorescente. Una volta che il transgene virale è nell’orientamento corretto, e quando applicabile, i DREADD possono indurre transitoriamente la neuromodulazione attraverso un ligando iniettato separatamente, cioè clozapina-N-ossido. Il protocollo è stato progettato per autenticare la ricerca sulla neuromodulazione inducibile nei neonati, in cui DREADDS viene iniettato per modulare selettivamente i CST. Il sistema a due virali funge da polizza assicurativa, garantendo che ogni cellula positiva al DREADD sia tracciabile sotto fluorescenza con alta fedeltà per convalidare le iniezioni.

Questo metodo aiuta anche a colmare il divario nella ricerca neonatale. La SCI pediatrica presenta le sue sfide e la ricerca che analizza la rigenerazione, la germinazione o la plasticità dovrebbe enfatizzare le differenze tra neonati e adulti 3,15,16,17. Ottimizzando la procedura chirurgica ed eseguendo studi anatomici precedenti con colorazione Nissl, sono state convalidate le coordinate per entrambe le iniezioni craniche e spinali. L’obiettivo era quello di fornire un metodo per doppie iniezioni in un ratto neonatale con maggiore fedeltà e capacità di sopravvivenza.

Per il modello attuale, il vettore anterogrado è stato iniettato nei corpi cellulari della corteccia somatomotoria utilizzando il bregma come riferimento^18,19. In termini di iniezioni spinali, il vettore retrogrado è stato iniettato nelle lamine V-VII, dove i terminali assoni CST risiedono^20,21. Ci sono molte domande fondamentali alla base di come alcuni modelli di lesione influenzano gli animali più giovani in modo diverso e come il successivo recupero diverge da un animale più anziano. Questo studio dimostra un robusto mezzo per studiare le lesioni cervicali e la recuperabilità della funzione degli arti anteriori nei roditori neonatali. Al contrario, la maggior parte degli studi precedenti ha affrontato il recupero della locomozione a seguito di lesioni lombari o toraciche 5,22,23,24. Accoppiando il vettore a doppio virus con la nuova tecnica di iniezione qui descritta, questo protocollo aiuta a mitigare alcuni problemi (cioè la sopravvivenza) che possono affliggere le indagini sui roditori neonatali. Questo metodo è robusto, pratico e versatile: lievi variazioni nella tecnica consentiranno di indirizzare diversi percorsi, ad esempio CST ventrale, CST dorsale e percorsi dorsali ascendenti.

Per questo sistema, un virus ad azione locale (ad esempio, AAV2) viene iniettato nella regione dei corpi cellulari neuronali di interesse. Un secondo virus trasportato retrogradamente che controlla l’espressione del virus locale viene iniettato ai terminali assoni per quella popolazione neuronale. Quindi, per definizione, solo i neuroni corticospinali sono etichettati. Il virus retroAAV-Cre è stato scelto con un promotore CMV costitutivamente attivo in quanto il plasmide shuttle viene utilizzato per generare diversi sierotipi AAV per l’espressione Cre-dipendente in diversi tipi cellulari. Per le iniezioni corticali, AAV2 è stato scelto con il transgene guidato dal promotore sinapsina-1 per limitare qualsiasi espressione ai neuroni. Poiché il sistema 2-virale si basa maggiormente sull’origine e sulla cessazione della popolazione neuronale di interesse, potrebbero essere utilizzati diversi promotori, se possono guidare l’espressione dei geni di interesse all’interno della popolazione neuronale di interesse. Ad esempio, il promotore neuronale eccitatorio, CamKII, potrebbe essere sostituito per la sinapsina-1. Oltre all’uso di questi sierotipi AAV, il trasporto retrogrado nei motoneuroni corticospinali adulti può anche essere ottenuto utilizzando l’alto lentivirus trasportabile retrogrado (HiRet)²⁵. I lentivirus HiRet utilizzano una glicoproteina chimerica di rabbia / VSV per indirizzare l’assorbimento alla sinapsi per il trasporto retrogrado. In combinazione con un promotore Tet-On, questo sistema 2-virale supporta l’espressione inducibile in modo retrogrado-dipendente^26,27.

I virus retrogradi inseriscono vettori nello spazio sinaptico di un neurone bersaglio, permettendogli di essere assorbito dall’assone di quella cellula e trasportato al corpo cellulare. Mentre i vettori lentivirali hanno avuto in precedenza un enorme successo, fornendo espressione a lungo termine negli studi di terapia genica, questo metodo ha ruotato verso i vettori virali adeno-associati per alcune semplici ragioni^26,28: AAV è più economico, altrettanto efficace e presenta meno di un onere logistico, dato che ha una designazione di livello di biosicurezza inferiore 29,30,31,32 . Mentre AAV2, il sierotipo più utilizzato, dimostra una robusta trasfezione degli assoni CST, i futuri ricercatori potrebbero notare che AAV1 offre una certa versatilità in quanto etichetta transynapticamente, mettendo così diverse possibili iterazioni in studi futuri³³. L’adattamento finale consiste nel codificare il virus retrogrado con Cre-ricombinasi in modo che più vettori anterogradi possano essere introdotti contemporaneamente, riducendo così gli sprechi di virus interni non necessari e massimizzando la probabilità che i DREADD si esprimano nell’orientamento corretto.

In definitiva, questo protocollo dimostra l’iniezione simultanea nella corteccia e nella colonna cervicale, mirando in particolare ai corpi cellulari e ai terminali assoni del tratto corticospinale, rispettivamente. La trasfezione ad alta fedeltà è visibile nella corteccia cerebrale e nel midollo spinale. Mentre il protocollo descritto è stato perfezionato per ratti Sprague Dawley di 5 giorni di età, è adatto per i giorni postnatali 4-10 con piccoli aggiustamenti all’anestesia e alle coordinate stereotassiche.

Protocol

Tutte le seguenti procedure chirurgiche e di cura degli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l’uso degli animali della Temple University. Il protocollo descritto è un intervento chirurgico di sopravvivenza e gli animali sono stati infine eutanasizzati, mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di pentobarbital di sodio al completamento dei loro punti temporali. 1. Preparazione pre-chirurgica Preparare almeno due aghi di vetro tirati per l’iniezione virale u…

Representative Results

Il successo dell’iniezione e del trasporto del vettore virale dovrebbe comportare la trasduzione dei neuroni unilaterali nel midollo spinale e nella corteccia motoria. La Figura 4 mostra l’etichettatura dei neuroni CST di strato V nella corteccia motoria di una sezione coronale cerebrale che esprime Cre-dipendente-DREADDs-mCherry co-iniettato con un’iniezione controlaterale della colonna vertebrale di rCre. Le sezioni erano colorate con l’anticorpo dsRed. <p class="jove_content" fo:keep-…

Discussion

La modulazione genetica inducibile dell’attività cerebrale con modificatori chemiogenetici iniettabili è un potente strumento per studiare i vari meccanismi che sono alla base del recupero dalla SCI. L’accuratezza del targeting per i recettori inducibili accoppiati a proteine G (DREADD) è ulteriormente aumentata se si considera che il tracciamento della fluorescenza convalida la precisione anatomica in istologia. Questo articolo discute un metodo affidabile per esplorare se l’inibizione o la stimolazione di percorsi n…

Materials

#11 scalpel blades	Roboz	RS-9801-11	For use with the scalpel.
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic SC injection and fluid bolus
4.0 silk suture	Ethicon	771-683G	For skin closure
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation
Ketamine (Ketaset)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Lab Standard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	To hold the neonatal sterotaxic holder in place
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor		51615	For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)	Bryan Roth’s lab through Addgene		DREADD plasmid
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.
Liquid bandage	NewSkin	985838	To apply along sutures following surgery and encourage wound healing
Wire Cage Lamp	ZooMed	LF10EC	To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally