Målretning af kortikospinalkanalen hos nyfødte rotter med en dobbeltviral vektor ved hjælp af kombineret hjerne- og rygkirurgi

Summary

Denne protokol demonstrerer en ny metode til anvendelse af genterapier på subpopulationer af celler hos nyfødte rotter i postnatale aldre 5-10 dage ved at injicere en anterograd kemogenetisk modifikator i den somatomotoriske cortex og en retrograd transportabel Cre-rekombinase i cervikal rygmarven.

Abstract

Vellykket håndtering af de forhindringer, der begrænser forskning på neonatale rotter, er vigtig for at studere forskellene i resultater, der ses i pædiatriske rygmarvsskader (SCI’er) sammenlignet med voksne SCI’er. Derudover kan pålidelig introduktion af terapier i målcellerne i centralnervesystemet (CNS) være udfordrende, og unøjagtigheder kan kompromittere effektiviteten af undersøgelsen eller terapien. Denne protokol kombinerer viral vektorteknologi med en ny kirurgisk teknik til nøjagtigt at introducere genterapier til nyfødte rotter på postnatal dag 5. Her introduceres en virus konstrueret til retrograd transport (retroAAV2) af Cre ved axonterminalerne af kortikospinale neuroner i rygmarven, hvor den efterfølgende transporteres til cellelegemerne. En dobbeltfloxed omvendt orientering (DIO) designerreceptor, der udelukkende aktiveres af designer drug (s) (DREADD) virus, injiceres derefter i hjernens somatomotoriske cortex. Denne dobbeltinfektionsteknik fremmer kun ekspressionen af DREADD’erne i de co-inficerede kortikospinalkanal (CST) neuroner. Således er den samtidige co-injektion af den somatomotoriske cortex og cervikale CST-terminaler en gyldig metode til undersøgelse af den kemogenetiske modulering af genopretning efter cervikale SCI-modeller hos nyfødte rotter.

Introduction

Mens SCI er en relativt sjælden forekomst i den pædiatriske befolkning, er den særlig traumatisk og forårsager et permanent handicap, der kræver enorm logistisk fremsyn. Desuden klassificeres en højere andel af pædiatriske SCI’er som cervikale og komplette sammenlignet med den voksne befolkning ^1,2. Et kendetegn på tværs af pattedyrarter er, at nyfødte kommer sig markant bedre fra SCI end voksne, og dette giver mulighed for at vurdere drivmekanismerne for genopretning i yngre populationer ^3,4,5. På trods af dette er der færre multimodale undersøgelser, der tackler nyfødte og spædbarnsgnaverforskning, dels på grund af den ekstra vanskelighed ved nøjagtigt at målrette udvalgte populationer af neuroner i de meget strammere anatomiske landemærker hos yngre dyr⁶. Denne artikel fokuserer på direkte injektion af højeffektive anterograd og retrograd adeno-associerede vektorer i rotterygmarven for at modulere større motorveje med anvendelse af Cre-dependent-DREADD’er, hvilket udvider rækkevidden af multimodale regenereringsundersøgelser.

Virale vektorer er vigtige biologiske værktøjer med en bred vifte af anvendelser, herunder introduktion af genetisk materiale til erstatning for målgener, opregulering af vækstproteiner og sporing af det anatomiske landskab i CNS ^7,8,9. Mange af de anatomiske detaljer i spinalmotoriske veje er blevet undersøgt ved hjælp af klassiske sporstoffer, dvs. biotinyleret dextranamin. Mens traditionelle sporstoffer har været medvirkende til at afdække neuroanatomi, er de ikke uden deres ulemper: de mærker vilkårligt veje, selvom de injiceres korrekt, og undersøgelser har vist, at de optages af beskadigede axoner^10,11,12. Derfor kan dette føre til forkerte fortolkninger i regenereringsundersøgelser, hvor afskårne axoner kan forveksles med regenererende fibre.

Følgende metode anvender det tovirale vektorsystem, der for nylig blev populariseret i modulationsundersøgelser, med to forskellige virale vektorer i to separate områder af den samme neuron^13,14. Den første er en vektor, der lokalt inficerer cellelegemerne af projektionsneuroner. Den anden er en retrograd vektor, der transporteres fra axonterminalerne i projektionsneuronerne (figur 1). Den retrograde vektor bærer Cre rekombinase, og den lokale vektor inkorporerer “Cre-On” dobbeltfloxed sekvens, hvori et fluorescerende protein (mCherry) er kodet. Det oprindelige transgen, der udtrykker både hM3Dq og mCherry, er omvendt i forhold til promotoren og flankeres af to LoxP-steder (figur 2). Således udtrykkes mCherry kun i de dobbelt transducerede projektionsneuroner, hvor Cre-rekombinase inducerer en rekombinationsbegivenhed mellem LoxP-stederne, vender transgenets orientering ind i den passende læseramme og tillader ekspression af både DREADD og det fluorescerende protein. Når det virale transgen er i den rigtige retning, og når det er relevant, kan DREADD’erne forbigående inducere neuromodulation gennem en separat injiceret ligand, dvs. clozapin-N-oxid. Protokollen blev designet til at autentificere inducerbar neuromodulationsforskning hos nyfødte, hvor DREADDS injiceres for at modulere CST’erne selektivt. Det tovirale system fungerer som en forsikringspolice, der sikrer, at hver DREADD-positiv celle kan spores under fluorescens med høj troskab for at validere injektionerne.

Denne metode hjælper også med at bygge bro over kløften i neonatal forskning. Pædiatrisk SCI præsenterer sine udfordringer, og forskning, der analyserer regenerering, spiring eller plasticitet, bør understrege forskellene mellem nyfødte og voksne 3,15,16,17. Ved at optimere det kirurgiske indgreb og udføre tidligere anatomiske undersøgelser med Nissl-farvning blev koordinaterne for både kranie- og rygmarvsinjektionerne valideret. Målet var at tilvejebringe en metode til dobbelt injektion i en neonatal rotte med øget troskab og overlevelsesevne.

For den nuværende model blev anterogradvektoren injiceret i cellelegemerne i den somatomotoriske cortex ved hjælp af bregma som reference^18,19. Med hensyn til rygmarvsinjektionerne blev retrogradvektoren injiceret i laminae V-VII, hvor CST-axonterminalerne befinder sig^20,21. Der ligger mange grundlæggende spørgsmål til grund for, hvordan visse læsionsmodeller påvirker yngre dyr forskelligt, og hvordan den efterfølgende bedring afviger fra et ældre dyr. Denne undersøgelse viser et robust middel til at studere livmoderhalsskader og genoprettelsen af forbensfunktionen hos neonatale gnavere. I modsætning hertil har størstedelen af tidligere undersøgelser behandlet genopretningsbevægelse efter lænde- eller thoraxskader 5,22,23,24. Ved at parre den dobbeltvirale vektor med den nye injektionsteknik, der er beskrevet her, hjælper denne protokol med at afbøde visse problemer (dvs. overlevelsesevne), der kan plage neonatal gnaverundersøgelser. Denne metode er robust, praktisk og alsidig: små variationer i teknikken giver mulighed for at målrette forskellige veje, dvs. ventral CST, dorsal CST og de stigende dorsale veje.

Til dette system injiceres en lokalt virkende virus (f.eks. AAV2) i regionen af neuronale cellelegemer af interesse. En anden retrograd transporteret virus, der styrer ekspressionen af den lokale virus, injiceres ved axonterminalerne for den neuronale population. Således er per definition kun kortikospinale neuroner mærket. RetroAAV-Cre-virus blev valgt med en konstitutivt aktiv CMV-promotor, da shuttleplasmidet bruges til at generere flere AAV-serotyper til Cre-afhængig ekspression i flere celletyper. Til kortikale injektioner blev AAV2 valgt med transgenet drevet af synapsin-1-promotoren for at begrænse enhver ekspression til neuroner. Fordi det 2-virale system er mere afhængig af oprindelsen og afslutningen af den neuronale population af interesse, kan flere forskellige promotorer bruges, hvis de kan drive ekspressionen af generne af interesse inden for den neuronale population af interesse. For eksempel kunne den excitatoriske neuronale promotor, CamKII, erstattes af synapsin-1. Ud over brugen af disse AAV-serotyper kan retrograd transport til umodne og i meget mindre grad voksne kortikospinale motorneuroner også opnås ved anvendelse af det høje retrograd transportable lentivirus (HiRet)²⁵. HiRet lentivirus bruger et kimært rabies/VSV-glycoprotein til at målrette optagelsen ved synapsen til retrograd transport. Kombineret med en Tet-On-promotor understøtter dette 2-virale system inducerbart udtryk på en retrogradafhængig måde^26,27.

Retrograde vira indsætter vektorer i det synaptiske rum af en målneuron, så den kan optages af cellens axon og transporteres til cellekroppen. Mens lentivirale vektorer tidligere har haft enorm succes og givet langsigtet ekspression i genterapistudier, drejede denne metode sig mod adeno-associerede virale vektorer af nogle få enkle grunde^26,28: AAV er mere økonomisk, tilsvarende effektiv og udgør mindre af en logistisk byrde, da den har en lavere biosikkerhedsniveaubetegnelse^29,30,31,32 . Mens AAV2, den mest anvendte serotype, demonstrerer robust transfektion af CST-axoner, kan fremtidige forskere bemærke, at AAV1 tilbyder en vis alsidighed, da den mærker transynaptisk og dermed fremsætter flere mulige iterationer i fremtidige undersøgelser³³. Den endelige tilpasning er at kode retrogradviruset med Cre-rekombinase, så flere anterogradvektorer kan introduceres samtidigt, hvorved unødvendigt internt virusaffald reduceres, og sandsynligheden for, at DREADD’erne udtrykker sig i den rigtige retning, maksimeres.

I sidste ende demonstrerer denne protokol samtidig injektion i cortex og cervikal rygsøjle, specifikt rettet mod henholdsvis cellelegemerne og axonterminalerne i kortikospinalkanalen. High-fidelity transfektion ses i hjernebarken og rygmarven. Mens den beskrevne protokol blev perfektioneret til Sprague Dawley rotter 5 dage gamle, er den velegnet til postnatale dage 4-10 med mindre justeringer af anæstesi og stereotaktiske koordinater.

Protocol

Alle følgende kirurgiske og dyreplejeprocedurer er blevet godkendt af Animal Care and Use Committee ved Temple University. Den beskrevne protokol er en overlevelsesoperation, og dyrene blev til sidst aflivet ved intraperitoneal injektion af 100 mg / kg natriumpentobarbital ved afslutningen af deres tidspunkter. 1. Prækirurgisk forberedelse Forbered mindst to trukne glasnåle til viral injektion ved hjælp af 3,5 nL glaskapillærpipetter; en nål til DREADD og en nål til rCre. Som …

Representative Results

Vellykket injektion og transport af den virale vektor bør resultere i transduktion af ensidige neuroner i rygmarven og motorcortex. Figur 4 demonstrerer mærkning af lag V CST-neuroner i motorcortex i en hjernekoronal sektion, der udtrykker Cre-afhængig-DREADDs-mCherry co-injiceret med en kontralateral rygsøjleinjektion af rCre. Sektionerne var farvet med dsRed antistof. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload…

Discussion

Inducerbar genetisk modulering af hjerneaktivitet med injicerbare kemogenetiske modifikatorer er et kraftfuldt værktøj til at studere de forskellige mekanismer, der ligger til grund for genopretningen fra SCI. Nøjagtigheden af målretningen for de inducerbare G-proteinkoblede receptorer (DREADD’er) øges yderligere, når man overvejer, at fluorescenssporing validerer den anatomiske præcision i histologi. Dette papir diskuterer en pålidelig metode til at undersøge, om hæmning eller stimulering af udvalgte neuronale…

Materials

#11 scalpel blades	Roboz	RS-9801-11	For use with the scalpel.
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic SC injection and fluid bolus
4.0 silk suture	Ethicon	771-683G	For skin closure
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation
Ketamine (Ketaset)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Lab Standard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	To hold the neonatal sterotaxic holder in place
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor		51615	For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)	Bryan Roth’s lab through Addgene		DREADD plasmid
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.
Liquid bandage	NewSkin	985838	To apply along sutures following surgery and encourage wound healing
Wire Cage Lamp	ZooMed	LF10EC	To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally