Målretting av kortikospinalkanalen hos nyfødte rotter med en dobbel-viral vektor ved bruk av kombinert hjerne- og ryggradskirurgi

Summary

Denne protokollen demonstrerer en ny metode for å anvende genterapier på underpopulasjoner av celler hos nyfødte rotter i postnatal alder 5-10 dager ved å injisere en anterograd kjemogenetisk modifikator i den somatomotoriske cortex og en retrograd transportabel Cre recombinase inn i livmorhalsen ryggmargen.

Abstract

Vellykket håndtering av hindringene som begrenser forskning på neonatale rotter er viktig for å studere forskjellene i utfall sett i pediatriske ryggmargsskader (SCIs) sammenlignet med voksne SCIer. I tillegg kan pålitelig innføring av terapier i målcellene i sentralnervesystemet (CNS) være utfordrende, og unøyaktigheter kan kompromittere effekten av studien eller terapien. Denne protokollen kombinerer viral vektorteknologi med en ny kirurgisk teknikk for nøyaktig å introdusere genterapier til nyfødte rotter på postnatal dag 5. Her introduseres et virus konstruert for retrograd transport (retroAAV2) av Cre ved aksonterminalene til kortikospinale nevroner i ryggmargen, hvor det deretter transporteres til cellelegemene. En dobbel-floxed invertert orientering (DIO) designer reseptor utelukkende aktivert av designer narkotika (er) (DREADD) virus blir deretter injisert i somatomotorisk cortex i hjernen. Denne dobbeltinfeksjonsteknikken fremmer uttrykket av DREADDene bare i de koinfiserte kortikospinalkanalene (CST) nevroner. Dermed er samtidig injeksjon av somatomotoriske cortex og cervical CST-terminaler en gyldig metode for å studere kjemogenetisk modulering av utvinning etter cervical SCI-modeller hos neonatale rotter.

Introduction

Mens SCI er en relativt sjelden forekomst i den pediatriske befolkningen, er det spesielt traumatisk og forårsaker en permanent funksjonshemming som krever enorm logistisk fremsyn. Videre er en høyere andel av pediatriske SCIer klassifisert som cervical og komplett sammenlignet med den voksne befolkningen ^1,2. Et kjennetegn på tvers av pattedyrarter er at nyfødte gjenoppretter seg betydelig bedre fra SCI enn voksne, og dette gir en mulighet til å vurdere kjøremekanismene for utvinning i yngre populasjoner ^3,4,5. Til tross for dette er det færre multimodale studier som takler nyfødt- og spedbarnsgnagerforskning, delvis på grunn av den ekstra vanskeligheten med nøyaktig målretting av utvalgte populasjoner av nevroner i de mye strammere anatomiske landemerkene til yngre dyr⁶. Denne artikkelen fokuserer på direkte injeksjon av svært effektive anterograde og retrograde adeno-assosierte vektorer i rotte ryggmargen for å modulere store motoriske veier ved anvendelse av Cre-dependent-DREADDs, utvide rekkevidden av multimodale regenereringsstudier.

Virale vektorer er viktige biologiske verktøy med en bredde av applikasjoner, inkludert innføring av genetisk materiale for å erstatte målgener, oppregulere vekstproteiner og spore det anatomiske landskapet til CNS ^7,8,9. Mange av de anatomiske detaljene i spinalmotoriske veier har blitt studert ved hjelp av klassiske sporstoffer, dvs. biotinylert dextranin. Mens tradisjonelle sporstoffer har vært medvirkende til å avdekke nevroanatomi, er de ikke uten sine ulemper: de merker ukritisk veier selv om de er riktig injisert, og studier har funnet ut at de blir tatt opp av skadede aksoner^10,11,12. Følgelig kan dette føre til feil tolkninger i regenereringsstudier der avskårne aksoner kan forveksles med regenererende fibre.

Følgende metode benytter det tovirale vektorsystemet som nylig ble popularisert i modulasjonsstudier, med to forskjellige virale vektorer i to separate områder av samme nevron^13,14. Den første er en vektor som lokalt infiserer cellelegemene til projeksjonsneuroner. Den andre er en retrograd vektor som transporteres fra aksonterminalene til projeksjonsnevronene (figur 1). Den retrograde vektoren bærer Cre recombinase, og den lokale vektoren inkorporerer “Cre-On” dobbelt-flokket sekvens der et fluorescerende protein (mCherry) er kodet. Det opprinnelige transgenet som uttrykker både hM3Dq og mCherry er invertert i forhold til promotoren og flankeres av to LoxP-steder (figur 2). Dermed uttrykkes mCherry bare i de dobbelttransduserte projeksjonsneuronene der Cre recombinase induserer en rekombinasjonshendelse mellom LoxP-stedene, snur orienteringen av transgenet inn i riktig leseramme og tillater ekspresjon av både DREADD og fluorescerende protein. Når virustransgenet er i riktig retning, og når det er aktuelt, kan DREADDene forbigående indusere nevromodulering gjennom en separat injisert ligand, dvs. clozapin-N-oksid. Protokollen ble designet for å autentisere induserbar nevromodulasjonsforskning hos nyfødte, hvor DREADDS injiseres for å modulere CST-ene selektivt. Det to-virale systemet fungerer som en forsikring, og sikrer at hver DREADD-positiv celle kan spores under fluorescens med høy troskap for å validere injeksjonene.

Denne metoden bidrar også til å bygge bro over gapet i nyfødtforskningen. Pediatrisk SCI presenterer sine utfordringer, og forskning som analyserer regenerering, spiring eller plastisitet bør understreke forskjellene mellom nyfødte og voksne 3,15,16,17. Ved å optimalisere den kirurgiske prosedyren og utføre tidligere anatomiske studier med Nissl-farging, ble koordinatene for både kraniale og spinale injeksjoner validert. Målet var å gi en metode for doble injeksjoner i en nyfødt rotte med økt troskap og overlevelsesevne.

For den nåværende modellen ble anterogradvektoren injisert i cellelegemene i den somatomotoriske cortex ved bruk av bregma som referanse^18,19. Når det gjelder spinalinjeksjonene, ble den retrograde vektoren injisert i laminae V-VII, hvor CST-aksonterminalene ligger^20,21. Det er mange grunnleggende spørsmål som ligger til grunn for hvordan visse lesjonsmodeller påvirker yngre dyr forskjellig, og hvordan den påfølgende utvinningen avviker fra et eldre dyr. Denne studien demonstrerer en robust måte å studere livmorhalsskader og gjenvinnbarheten av forbensfunksjonen hos nyfødte gnagere. I motsetning til dette har flertallet av tidligere studier adressert gjenopprettingsbevegelse etter lumbale eller thoraxskader 5,22,23,24. Ved å koble den dobbeltvirale vektoren med den nye injeksjonsteknikken som er beskrevet her, bidrar denne protokollen til å redusere visse problemer (dvs. overlevelsesevne) som kan plage neonatale gnagerundersøkelser. Denne metoden er robust, praktisk og allsidig: små variasjoner i teknikken vil tillate målretting av forskjellige veier, dvs. ventral CST, dorsal CST og de stigende dorsale banene.

For dette systemet injiseres ett lokalt virkende virus (f.eks. AAV2) i regionen av nevroncellelegemer av interesse. Et annet retrograd transportert virus som styrer uttrykket av det lokale viruset, injiseres på aksonterminalene for den nevronale befolkningen. Således er per definisjon bare kortikospinale nevroner merket. RetroAAV-Cre-viruset ble valgt med en konstitutivt aktiv CMV-promotor da skyttelplasmidet brukes til å generere flere AAV-serotyper for Cre-avhengig ekspresjon i flere celletyper. For kortikale injeksjoner ble AAV2 valgt med transgenet drevet av synapsin-1-promotoren for å begrense ethvert uttrykk til nevroner. Fordi det 2-virale systemet er mer avhengig av opprinnelsen og avslutningen av nevronpopulasjonen av interesse, kan flere forskjellige promotorer brukes, hvis de kan drive uttrykket av gener av interesse innenfor nevronpopulasjonen av interesse. For eksempel kan den eksitatoriske nevronpromotoren, CamKII, erstattes av synapsin-1. I tillegg til bruken av disse AAV-serotypene, kan retrograd transport til umodne, og i mye mindre grad voksne kortikospinale motornevroner også oppnås ved bruk av det høye retrograde transportable lentiviruset (HiRet)²⁵. HiRet lentivirus bruker et kimært Rabies/VSV-glykoprotein for å målrette opptak i synapsen for retrograd transport. Kombinert med en Tet-On-promotor støtter dette 2-virale systemet induserbart uttrykk på en retrograd avhengig måte^26,27.

Retrograde virus setter vektorer inn i det synaptiske rommet til et målnevron, slik at det kan tas opp av cellens axon og transporteres til cellekroppen. Mens lentivirale vektorer tidligere har hatt enorm suksess, og gir langsiktig uttrykk i genterapistudier, svingte denne metoden mot adenoassosierte virale vektorer av noen få enkle grunner^26,28: AAV er mer økonomisk, tilsvarende effektiv og presenterer mindre logistisk byrde, gitt at den har en lavere biosikkerhetsnivåbetegnelse^29,30,31,32 . Mens AAV2, den mest brukte serotypen, demonstrerer robust transfeksjon av CST-aksoner, kan fremtidige forskere merke seg at AAV1 gir en viss allsidighet da den merker transynaptisk, og dermed legger frem flere mulige iterasjoner i fremtidige studier³³. Den endelige tilpasningen er å kode det retrograde viruset med Cre-recombinase slik at flere anterograde vektorer kan introduseres samtidig, og dermed redusere unødvendig internt virusavfall og maksimere sannsynligheten for at DREADDene uttrykker seg i riktig retning.

Til slutt demonstrerer denne protokollen samtidig injeksjon i cortex og cervical ryggraden, spesielt rettet mot henholdsvis cellelegemene og aksonterminalene i kortikospinalkanalen. High-fidelity transfeksjon ses i hjernebarken og ryggmargen. Mens protokollen som er beskrevet ble perfeksjonert for Sprague Dawley rotter 5 dager, er den egnet for postnatal dag 4-10 med mindre justeringer av anestesi og stereotaktiske koordinater.

Protocol

Alle følgende kirurgiske og dyrepleieprosedyrer er godkjent av Animal Care and Use Committee ved Temple University. Protokollen som beskrives er en overlevelsesoperasjon, og dyrene ble til slutt avlivet ved intraperitoneal injeksjon av 100 mg/kg natriumpentobarbital ved ferdigstillelse av tidspunktene. 1. Pre-kirurgisk forberedelse Forbered minst to trukket glass nåler for viral injeksjon ved hjelp av 3,5 nL glass kapillære pipetter; en nål for DREADD og en nål for rCre. Som et …

Representative Results

Vellykket injeksjon og transport av virusvektoren bør resultere i transduksjon av ensidige nevroner i ryggmargen og motorbarken. Figur 4 demonstrerer merkingen av lag V CST-nevroner i motorbarken til en hjernekoronal seksjon som uttrykker Cre-dependent-DREADDs-mCherry co-injisert med en kontralateral ryggradsinjeksjon av rCre. Seksjonene ble farget med dsRed antistoff. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/626…

Discussion

Inducible genetisk modulering av hjernens aktivitet med injiserbare kjemogenetiske modifikatorer er et kraftig verktøy for å studere de ulike mekanismene som ligger til grunn for utvinning fra SCI. Nøyaktigheten av målrettingen for de induserbare G-proteinkoblede reseptorene (DREADDs) økes ytterligere når man vurderer at fluorescenssporing validerer den anatomiske presisjonen i histologi. Dette papiret diskuterer en pålitelig metode for å undersøke hvorvidt inhibering eller stimulering av utvalgte nevronveier (m…

Materials

#11 scalpel blades	Roboz	RS-9801-11	For use with the scalpel.
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic SC injection and fluid bolus
4.0 silk suture	Ethicon	771-683G	For skin closure
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation
Ketamine (Ketaset)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Lab Standard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	To hold the neonatal sterotaxic holder in place
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor		51615	For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)	Bryan Roth’s lab through Addgene		DREADD plasmid
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.
Liquid bandage	NewSkin	985838	To apply along sutures following surgery and encourage wound healing
Wire Cage Lamp	ZooMed	LF10EC	To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally