FluorescensMikroskopi til ATP Internalization medieret af makropinocytose i menneskelige tumorceller og tumor-xenografted mus
Summary
Vi udviklede en reproducerbar metode til at visualisere internaliseringen af ikkehydrolyzable fluorescerende adenosin triphosphat (ATP), en ATP surrogat, med høj cellulær opløsning. Vi validerede vores metode ved hjælp af uafhængige in vitro og in vivo assays-human tumor celle linjer og immundefekt mus xenografted med human tumor væv.
Abstract
Adenosin triphosphat (ATP), herunder ekstracellulær ATP (eATP), har vist sig at spille en betydelig rolle i forskellige aspekter af tumorigenese, såsom lægemiddelresistens, epitel-mesenkymal overgang (EMT), og metastaser. Intratumoral eATP er 103 til 104 gange højere i koncentration end i normalt væv. Mens eATP fungerer som en messenger til at aktivere purinergisk signalering for EMT induktion, det er også internaliseret af kræftceller gennem opreguleret makropinocytose, en bestemt type endokytose, til at udføre en bred vifte af biologiske funktioner. Disse funktioner omfatter at levere energi til ATP-kræver biokemiske reaktioner, donere fosfat grupper under signal transduktion, og lette eller fremskynde genekspression som en transskriptionel cofaktor. ATP er let tilgængelig, og dens undersøgelse af kræft og andre områder vil uden tvivl stige. EATP-undersøgelsen er dog stadig på et tidligt stadium, og uløste spørgsmål forbliver ubesvarede, før de vigtige og alsidige aktiviteter, der spilles af eATP og internaliseret intracellulær ATP, kan optrævle fuldt ud.
Disse forfatteres laboratoriers bidrag til disse tidlige eATP-undersøgelser omfatter mikroskopisk billeddannelse af ikke-hydrolyserbar lysstofrørs-ATP, kombineret med lysstofrør med høj og lav molekylvægt, der tjener som makropinocytose og endokytosesporere samt forskellige endokytosehæmmere, til at overvåge og karakterisere eATP-internaliseringsprocessen. Denne billeddannelse modalitet blev anvendt til tumor cellelinjer og immundefekt mus, xenografted med human kræft tumorer, at studere eATP internalisering in vitro og in vivo. Dette papir beskriver disse in vitro og in vivo protokoller, med vægt på at ændre og finjustere assay betingelser, således at makropinocytosis-/endocytosis-medieret eATP internalisering assays kan udføres med succes i forskellige systemer.
Introduction
Den opportunistiske optagelse af intratumoral ekstracellulære (dvs.) næringsstoffer er for nylig blevet udnævnt til et centralt kendetegn for kræftmetabolisme1. Et af disse vigtige næringsstoffer er ATP, da koncentrationen af ieATP er 103 og 104 gange højere end den, der findes i normalt væv, i området på flere hundrede μM til lav mM2,3,4,5. Som et centralt energi- og signalmolekyle spiller ATP en central rolle i cellulær metabolisme i kræft og sunde celler6,7,8. Ekstracellulær ATP er ikke kun involveret i kræftcellevækst, men det fremmer også lægemiddelresistens9. Tidligere ukendt funktioner ATP, såsom hydrotropisk aktivitet, er for nylig blevet identificeret, hvilket implicerer ATP involvering i sygdomme som Alzheimers10. Faktisk ser det ud til, at vores forståelse af ATP og dens funktioner i kræftceller, raske celler og andre syge celler langt fra er komplet. Men på grund af ATP’s ustabilitet og høje omsætning i celler er det teknisk udfordrende at overvåge ATP’s bevægelse på tværs af cellemembranen og ind i cellen.
For at løse dette problem og udfylde behovet for dette forskningsområde blev der udviklet en metode, hvor ikkehydrolyzable fluorescerende ATP (NHF-ATP) (Figur 1) blev brugt som surrogat til at visualisere internaliseringen af ATP og observere den intracellulære rumlige lokalisering af internaliseret ATP, både in vitro og in vivo11,12 . NHF-ATP har vist sig at erstatte endogene ATP til at undersøge ATP bevægelse på tværs af dyrecellemembraner, både i kræft cellelinjer og i human tumorvæv xenografted på immundefekt mus11,12. Desuden blokerede administration af makropinocytosehæmmere til celler eATP-internalisering, hvilket tyder på, at intracellulær optagelse af eATP indebærer en makropinocytotisk mekanisme9,11,12. Denne protokol tillader immunbaseret colabeling mod cellespecifikke proteiner og dermed identifikation af, hvilken celletype internaliserer NHF-ATP. Ved hjælp af in vivo tumor xenografts og høj opløsning mikroskopi, NHF-ATP kan visualiseres rumligt på tværs af vævsprøven og endda inden for en enkelt celle. Disse metoder tillader også kvantitativ analyse, såsom procentdelen af cellulær optagelse, antallet af makropinocytotiske vesikler og internalisering kinetik. Dette papir beskriver i detaljer, hvordan NHF-ATP, der arbejder alene eller sammen med endokritose-tracer fluorescerende dextrans13,14,15,16, kan bruges i forskellige eksperimentelle indstillinger til at studere ATP’s internalisering og intracellulære lokalisering, efter internalisering i celler.
Figur 1: Strukturer af ikkehydrolyzable fluorescerende ATP og tetramethylrhodamin mærket høj molekylvægt fluorescerende dextran. (A) Struktur nhf-ATP. (B) Skematisk repræsentation af HMWFD. Forkortelser: ATP = adenosin triphosphat; NHF-ATP = ikkehydrolyzable fluorescerende ATP; TMR = tetramethylrhodamin; HMWFD = høj molekylvægt fluorescerende dextran. Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Representative Results
Discussion
En metode blev udviklet til rumlig, tidsmæssig og kvantitativ analyse af cellulær internalisering af ikkehydrolyzable ATP. Denne metode er bredt anvendelig til brug i forskellige biologiske systemer, herunder forskellige tumorigenic modeller, som vi leverer teknisk instruktion og repræsentative data. For at opnå fortolkelige data under in vivo ATP-internaliseringsundersøgelser (protokollens afsnit 4) er det afgørende at begrænse den eksperimentelle tid, der er gået fra intratumoral dextran-injektion til …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cryosectioning blev udført på stedet på Ohio University Histopathology Core. Dette arbejde blev delvist støttet af start-up midler (Ohio University College of Arts &Sciences) til C Nielsen; NIH giver R15 CA242177-01 og RSAC-prisen til X Chen.
Materials
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker – orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical – sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
- Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008 (2008).
- Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101 (2013).
- Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
- Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).
- Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
- Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
- Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
- Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
- Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
- Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
- Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
- Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
- Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
- Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
- Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
- Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
- Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154 (2007).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
