Summary
우리는 높은 세포 분해능을 가진 ATP 대리인 비수성 아데노신 삼위산염(ATP)의 내재화를 시각화하는 재현 가능한 방법을 개발했습니다. 우리는 독립적인 체외 및 생체 내 분석-인간 종양 세포주 및 면역결핍 마우스 를 사용하여 인간 종양 조직과 이식된 우리의 방법을 검증했습니다.
Abstract
세포외 ATP(eATP)를 포함한 아데노신 트리호스페이트(ATP)는 약물 내성, 상피-중간엽 전이(EMT) 및 전이와 같은 종양 발생의 다양한 양상에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 종양 내 eATP는 정상 조직보다 농도가 103 ~ 104 배 높다. eATP는 EMT 유도를 위한 순수성 신호 전달을 활성화하기 위한 메신저로서 기능하지만, 또한 특정 유형의 내분세포증인 고세포증을 통해 암세포에 의해 내면화되어 다양한 생물학적 기능을 수행한다. 이러한 기능에는 ATP가 요구하는 생화학 반응에 에너지를 제공하고, 신호 변환 중에 인산염 그룹을 기증하고, 전사 보조 인자로서 유전자 발현을 촉진하거나 가속화하는 것이 포함됩니다. ATP는 쉽게 사용할 수 있으며 암 및 기타 분야에서의 연구는 의심 할 여지없이 증가 할 것입니다. 그러나 eATP 연구는 초기 단계에 남아 있으며 eATP와 내부화된 세포내 ATP가 연주하는 중요하고 다재다능한 활동이 완전히 해명되기 전에 해결되지 않은 질문은 여전히 답이 없습니다.
이러한 초기 eATP 연구에 대한 이러한 저자의 실험실의 기여는 비 가수분해성 형광 ATP의 현미경 이미징을 포함하며, 고분자 및 저분자 형광 덱스트랜스와 결합하여 거시피노세포증 및 내세포 증산 억제제뿐만 아니라 다양한 내세포증 억제제역할을 하며, 내부화를 감시하고 특성화합니다. 이러한 이미징 양식은 종양 세포주 및 면역형 마우스에 적용되었으며, 인간 암 종양과 이식된 이노노이식, 체외 및 생체 내eATP 내재화를 연구하였다. 이 백서는 이러한 체외 및 생체 내 프로토콜을 설명하며, 매크로피노시토시스/내세포 매개 eATP 내분비분석 분석이 다른 시스템에서 성공적으로 수행될 수 있도록 분석 조건을 수정및 미세 조정하는 데 중점을 두고 있습니다.
Introduction
종양 외 세포 (즉) 영양소의 기회적 섭취는 최근 암 대사1의핵심 특징으로 명명되었습니다. 이러한 중요한 영양소 중 하나는 ATP이며, ieATP의 농도는 정상 조직에서 발견되는 것보다 103 및 104 배 더 높으며, 수백 μM에서 낮은 mM2,3,4,5에있다. 주요 에너지 및 신호 분자로서 ATP는 암과 건강한 세포에서 세포 대사에 중심적인 역할을 한다6,7,8. 세포외 ATP는 암세포 성장에 관여할 뿐만 아니라 약물 내성9도촉진한다. 이전에는 수중성 활동과 같은 ATP의 인식되지 않은 기능이 확인되어 알츠하이머10과같은 질병에 ATP가 관여하는 것을 연루시킨다. 실제로, ATP의 우리의 이해와 암세포에 있는 그것의 기능, 건강한 세포 및 그밖 병된 세포는 완전하지 않습니다 보입니다. 그러나, ATP의 불안정성과 세포에 있는 높은 이직률 때문에, 세포막을 통해 그리고 세포로 ATP의 운동을 감시하는 것은 기술적으로 도전적입니다.
이러한 문제점을 해결하고 이 연구 영역의 필요성을 채우기 위해, ATP의 내재화를 시각화하고 생체 내 및 생체내 11,12의 내재된 ATP의 세포 내 공간 국소화를 관찰하기 위해 비수성 형광 ATP(NHF-ATP)(도1)를대리로 사용하는 방법이개발되었다. . NHF-ATP는 암 세포주 및 면역형 마우스11,12에이식된 인간 종양 조직 에서 동물 세포막을 통해 ATP 운동을 조사하기 위해 내인성 ATP를 대체하는 것으로 입증되었다. 더욱이, 세포에 대식세포 억제제를 투여하여 eATP 내산화를 막아, eATP의 세포내 섭취가9,11,12의대식세포메커니즘을포함한다는 것을 시사한다. 이 프로토콜은 세포 특정 단백질에 대한 면역 기반 공동 라벨링을 허용하고 따라서 어떤 세포 유형이 NHF-ATP를 내면화시키는지 식별합니다. 생체 종양 이종이이식 및 고해상도 현미경 검사법을 사용하여 NHF-ATP는 조직 샘플 전반에 걸쳐 심지어 단일 세포 내에서도 공간적으로 시각화될 수 있습니다. 또한 이러한 방법은 세포 섭취 비율, 거시세포 소포 수 및 내재화 운동과 같은 정량적 분석을 허용합니다. 이 논문은 NHF-ATP가 세포 내재화에 따라 ATP의 내재화 및 세포 내 국소화를 연구하기 위해 다양한 실험 환경에서 어떻게 사용하거나 내분비 추적형 형광덱스트랜스(13,14,15,16)와함께 작업하는지 자세히 설명합니다.
그림 1: 비가수성 형광 ATP 및 테트라메틸lrhodamine의 구조는 높은 분자량 형광 dextran을 표시. (A)NHF-ATP의 구조. (B)HMWFD의 회로도 표현. 약어: ATP = 아데노신 트리호스페이트; NHF-ATP = 비가수성 형광 ATP; TMR = 테트라메틸lrhodamine; HMWFD = 고분자 량 형광 드엑스트라른. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
여기에 보고된 모든 절차는 오하이오 대학의 IACUC 및 NIH에 따라 수행되었습니다.
1. 비가수성 형광 ATP (NHF-ATP) 및 덱스트랜스 의 선택
- 형광파장(예를 들어, 적절한 필터가 장착된 이미징 시스템)을 기반으로 한 비소-공주 NHF-ATP(도1A)및 내분비 추적기, 고분자 및 저분자형 형광 덱스트랜스(TMR-HMWFD 및 TMR-LMWFD)(도1B)를선택한다.
2. ATP 현지화 연구, 시험관 내 (그림 2)
그림 2: ATP 내산화를 검사하는 시험관 내 절차. 형광 현미경 을 사용하여 배양 된 암세포에서 세포 외 ATP의 내성을 시각화하는 프로토콜의 회로도 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 세포 배양 및 세포의 준비
참고: 조직 배양 후드에서 멸균 조건하에서 세포 배양을 수행합니다.- Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)를 준비, 포함 10% (v/v) 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % (v/v) 페니실린 / 연쇄 절제술 (이하라고 함). DMEM/FBS), 멸균 인산완충식식염(PBS), 37°C 수조에서 0.25% 트립신/에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)이 있다.
- 100mm 조직 배양 접시에 DMEM/FBS에 있는 인간 암 세포를 배양합니다. 5% CO2 대기로 37°C로 설정된 인큐베이터에서 세포를 유지한다.
- 세포가 합류에 도달하면 먼저 배양 배지를 제거하여 세포를 통과합니다. 다음으로, 멸균 PBS의 5mL로 접시를 헹구고, PBS를 제거하고, 0.25%의 트립신3mL을 추가한다. 5 분 동안 5 % CO2 분위기에서 37 °C에서 배양하십시오.
- 접시를 검색한 다음 DMEM/FBS 6mL을 추가하여 트립시니화를 중지합니다. 현탁액의 세포를 15mL 원물 관및 원심분리기에서 800 × g에서 5분 동안 젤렛세포로 이송한다.
- 원심 분리 후, 상류체를 흡인하고 10 mL의 DMEM/FBS를 사용하여 파이펫팅으로 셀 펠릿을 재보페합니다.
- 혈종계를 사용하여 세포 밀도 와 생존가능성을 계산합니다. DMEM/FBS를 사용하여 셀 현탁액을 ~7.5 × 104 세포/mL의 밀도로 희석한다.
- 커버립 및 파종 셀 준비
- 12mm 커버립을 70% 에탄올로 씻고 섬세한 작업 물티슈로 조심스럽게 닦으신다. 오토클레이브를 통해 커버립과 한 쌍의 집게를 살균합니다.
- 조직 배양 후드에서, 24 웰 조직 배양 플레이트의 각 우물에 하나의 커버 슬립을 배치하는 집게를 사용합니다.
참고: 나중에, 커버슬립은 세포와 함께, 화상 진찰을 위한 현미경 슬라이드에 직접 장착될 것입니다. - 세포 현탁액의 300 μL(DMEM/FBS의 세포)을 잘 당 ~2.5 × 104세포의 파종 밀도로, 멸균 커버립을 함유한 24웰 플레이트에 분배한다. 5% CO2 흐름으로 37°C의 멸균 조건에서 배양합니다.
- 세포의 기아
- 시드 후 24시간, 각 우물에서 DMEM/FBS를 제거합니다. 즉시 300 μL의 전동 세럼없는 DMEM을 각 우물에 추가하여 세포 외 영양소의 섭취를 유도하기 위해 15-18 h의 세포를 세럼으로 굶주리게합니다.
참고: 15-18 h 의 기아 기간은 중요한 매개 변수입니다.
- 시드 후 24시간, 각 우물에서 DMEM/FBS를 제거합니다. 즉시 300 μL의 전동 세럼없는 DMEM을 각 우물에 추가하여 세포 외 영양소의 섭취를 유도하기 위해 15-18 h의 세포를 세럼으로 굶주리게합니다.
- NHF-ATP 및 HMWFD/LMWFD 솔루션 준비
- 분석 균형을 사용하여 고분자 중량(70kDa) 형광 TMR-dextran(TMR-HMWFD, 1 mg/mL), 매크로피노솜 을 시각화하기 위한 트레이서 또는 혈청 이없는 DMEM의 NHF-ATP(10 μmol/L)를 1.5m의 마이크로퓨리 튜브에 장착할 수 있습니다. 빛으로부터 보호되는 튜브를 37°C 의 수조에 15분 동안 배치합니다.
- 12,000 × g의 원심분리기는 실온에서 5분 동안. 명확한 상체를 새로운 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기고, 어떤 펠릿이나 파편도 불용성 결정을 제거하기 위해 그대로 둡니다.
- 각 우물의 세포에 2.4.1 단계로부터 용액을 추가하고 37°C에서 30분 동안 세포를 배양한다.
참고: HMWFD 및 NHF-ATP 용액이 세포와의 공동 배양을 위해 혼합되어야 하는 경우 최종 농도의 2배에서 두 솔루션을 모두 준비합니다. 솔루션은 최종 정확한 작업 농도를 달성하기 위해 나중에 1:1 비율로 혼합됩니다. 시약이 빛에 민감하기 때문에 빛을 피하십시오.
- 세포 치료 및 고정
- 신선한 24웰 플레이트에서 미리 따뜻해진 PBS 500 μL을 각 5개의 우물에 분배합니다.
- 세포 배양 후, 조심스럽게 집게를 사용하여 각 커버 슬립을 데리러. 전동 된 PBS의 500 μL에 찍어 각 커버 슬립을 헹구세요. PBS가 채워진 5개의 우물을 사용하여 5회 반복합니다.
참고: 이 실험의 성공에 는 세포 에 커버립의 부드러운 세척이 중요합니다. - 최종 PBS 세척 후, 섬세한 작업 닦기에서 커버슬립을 탭하여 여분의 PBS를 흡수하고 커버슬립을 즉시 감기(4°C) 3.7% 포름알데히드로 옮기고, 24웰 플레이트에 미리 로드된다. 실온에서 셀을 15분 동안 수정합니다.
- 세포가 고정되는 동안, 미리 깨끗한 현미경은 70%에탄올로 미끄러합니다. 우물에서 커버립을 제거하고 핵 얼룩 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 포함하는 수성 장착 매체의 5 μL을 사용하여, 슬라이드에 장착, 커버 슬립 당. 종이 타월이나 섬세한 작업 와이프와 함께 초과 PBS를 부드럽게 얼룩.
- 형광 현미경 검사및 이미지 수집
- 위의 단계 후 2~24시간 후, 피불화 이미징 시스템 및 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 세포 및 내재화된 HMWFD 및/또는 NHF-ATP의 이미지를 캡처합니다.
참고: 이 하위 섹션에서는 피광성 이미징 기능이 장착된 Nikon NiU 현미경 및 니콘 NIS 엘리먼트 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득하는 단계를 설명합니다. 그러나 다른 유사한 이미징 시스템 및 획득 소프트웨어가 사용될 수 있습니다. 제조업체의 운영 지침을 따르십시오.- 쌍안경 모드에서 수직 성형 광원 현미경의 무대에 슬라이드를 놓습니다. 이미징 프로그램에 액세스합니다.
- 10x 목표를 선택하고 스테이지를 조정하여 포커스를 정의하고, 슬라이드를 서문 방식으로 좌측에서 오른쪽으로 스캔하여 관심 영역을 식별합니다.
참고: 관심 영역을 식별하는 것은 세포 유형마다 다르며, 일부 세포주/암 유형은 TMR-HMWFD 및/또는 NHF-ATP 섭취량의 다양하고 뚜렷한 정도를 나타낸다. - 40배 목표를 선택하고 현미경의 토글을 사용하여 쌍안경 모드에서 이미지 캡처 모드로 전환합니다.
- 이미징 프로그램의 라이브 품질 아이콘을 클릭하여 이미지를 보고 수집합니다.
- 주석 및 측정 도구 모음의 OC 패널을 사용하여 각 필터 큐브 또는 형광 채널에 대한 노출 매개 변수를 정의합니다.
참고: 신호 강도가 다르므로 각 채널에 적절한 노출 시간을 선택합니다. 예를 들어 DAPI용 노출 시간은 200ms, HMWFD의 경우 2개, NHF-ATP의 경우 4s를 선택합니다. 노출 시간이 채널당 결정되면 채널당 모든 이미지에 대해 이 설정을 사용하며, 다른 치료 또는 조건과 함께 사용합니다. - 각 채널에 대한 노출 설정이 설정된 후 멀티채널 획득 도구 모음을 사용하여 정의된 노출 설정이 있는 3채널 이미지를 획득합니다.
참고: 멀티채널 ND 획득 모드를 통한 이미지 수집을 통해 동일한 시야의 각 채널에 대해 자동 이미지 캡처를 수행할 수 있습니다. 포탑 변경 사이에 셔터가 자동으로 닫힙습니다. - 또는 필터 큐브 사이를 전환하고, 노출 시간을 설정하고, 각 채널에 대한 이미지 수집 사이에 셔터를 닫고, 개별 채널에 대해 촬영한 각 이미지를 오버레이하여 멀티채널 이미지를 수동으로 획득합니다.
참고: ND 획득 모드는 이 프로세스를 자동화하고 병합된 이미지를 제공합니다. - 이미지를 .nd2 파일로 저장합니다(니콘 요소 형식은 메타데이터를 저장합니다). 병합된 채널 이미지와 개별 채널 이미지를 포함한 TIF 파일을 저장합니다.
참고: TIF 파일은 광범위한 소프트웨어 응용 프로그램과 함께 사용할 수 있습니다. - 분석 도구 모음의 개체 수 피쳐를 사용하여 저장된 .nd2 이미지 파일에서 NHF-ATP, TMR-HMWFD 및/또는 TMR-LMWFD 양성 셀수를 계산합니다.
- 분석 프로그램을 통해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
- 위의 단계 후 2~24시간 후, 피불화 이미징 시스템 및 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 세포 및 내재화된 HMWFD 및/또는 NHF-ATP의 이미지를 캡처합니다.
- 데이터 정량화 및 분석
- 각 조건에 대해 분석, 정량화를 위한 이미지 50 100 셀. 데이터 분석 소프트웨어(상피 이미징 시스템 또는 기타 소프트웨어에 포함된 소프트웨어)를 사용하여 셀당 형광 소포의 평균 수를 계산하고 계산합니다.
- 적절한 통계 방법을 사용하여 정량화된 결과를 분석합니다.
3. 종양에서 ATP 내재화, 전 비보 (그림 3)
그림 3: ATP 내산화를 검사하는 생체 내 절차. 극저온절과 형광 현미경 을 사용하여 종양 이체 이식에서 세포외 ATP의 내산화를 시각화하는 프로토콜의 회로도 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 이식을 위한 세포 배양의 준비
- FBS로 보충된 DMEM을 사용하여 225cm2 플라스크에서 37°C에서 80%로 암세포를 80%로 성장시키고, 최종 농도는 10%(v/v) 및 페니실린/연쇄절제술을 1%(v/v)로 증가시다.
- PBS의 10mL로 두 번 세포를 씻으시다. 37 °C에 사전 웜 0.25 % 트립신 / EDTA. 트립신 /EDTA의 8 mL을 추가하고 2 분 동안 37 ° C에서 인큐베이션.
- 세포가 플라스크 바닥에서 분리되기 시작하면 10mL 멸균 세로지학적 파이펫을 사용하여 DMEM/FBS8mL을 추가합니다. 부착 된 세포를 제거하기 위해 두 번 흡인. 파이펫을 사용하여 플라스크에서 분리된 세포를 50mL 원추형 튜브로 이송합니다.
- 10mL 파이펫을 사용하여 DMEM/FBS 10mL를 추가하고 동일한 50mL 원전 튜브에 남아있는 모든 부동 셀을 수집합니다.
- 세포 현탁액을 600 × g,4°C에서 4분 동안 원심분리합니다. 상체를 제거하고 얼음 차가운 PBS의 1 mL에서 세포를 다시 중단합니다.
- 혈종계를 사용하여 세포 밀도를 계산합니다. 셀 서스펜션을 계산하는 동안 얼음 에 보관하십시오.
- 세포 현탁액을 600 × g,4°C에서 4분 동안 원심분리합니다. 상체를 제거하고 세포 밀도가 PBS의 100 μL 당 5 × 106 세포가되도록 얼음 차가운 PBS에서 세포를 일시 중단합니다. 세포 현탁액을 1.5 mL 마이크로센심분리기 튜브로 이송한다.
- 이종이 이식 종양 개발을 위한 암세포의 피하 주입
- 암세포 주입을 위해 정밀 글라이드 바늘(27G 바늘)을 장착한 라텍스 프리 주사기(1mL)를 사용하십시오.
- 세포 현탁액(PBS 의 100 μL에서 5×106)을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 이송한다. 세포를 주사기에 그립니다.
- 면역 결핍 (누드) 마우스의 측면에 주입 사이트를 선택하고 부드럽게 75 %의 에탄올을 사용하여 피부를 청소합니다. 섬세한 작업 닦아 여분의 에탄올을 닦아.
- 피하 주사의 경우 바늘을 피부에 약 10° 각도로 유지하십시오. 바늘 끝을 삽입, 벨, 피부 바로 아래, 바늘의 단지 1-2 mm 피부 외부 볼 수 있도록. 주사기에서 세포를 약 10s 이상 천천히 분배합니다.
- 전체 부피를 주입한 후 바늘을 3-5s에 계속 고정한 다음 바늘을 철회하고 손가락을 사용하여 주입된 내용의 누출을 방지하기 위해 3-5초 동안 주입 부위에 부드럽지만 단단한 압력을 가한다.
- 종양이 200-500mm3의부피에 도달할 때까지 vernier 캘리퍼를 사용하여 종양 성장을 모니터링하고 측정합니다.
- 종양 후 절제술을 사용할 HMWFD 및 NHF-ATP 솔루션의 준비
- 300 μL의 16 mg/mL HMWFD를 세럼이 없는 DMEM(배양 배지)으로 녹이고, 37°C 수조에서 30분 동안 배양하고, 원심분리기는 위에서 설명한 바와 같이 5분 동안 12,000g의 ×. 솔루션을 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브로 전송합니다.
- NHF-ATP 아날로그 주식(1mM)의 40 μL을 혈청 이없는 DMEM 160 μL에 추가하여 0.2mM NHF-ATP 솔루션을 준비합니다.
- 실험용 우물 준비
참고: 이 실험 설계는 HMWFD + NHF-ATP의 세포 내산화를 분석하여 매크로피노좀에 의한 섭취를 나타냅니다.- 다음과 같이 우물을 준비 : 음 #1, 제어 : 혈청무료 DMEM의 200 μL; 음 #2, 제어: 16 mg/mL LMWFD + 100 μL 의 혈청 없는 DMEM = 8 mg/mL LMWFD의 200 μL; 음 #3, 제어: 0.2 mM NHF-ATP + 혈청 없는 DMEM의 100 μL = 0.1 mM NHF-ATP의 200 μL; 음 #4; 실험: 16 mg/mL HMWFD + 0.2mM NHF-ATP의 100 μL = 0.1m NHF-ATP의 200 μL 및 8 mg/mL HMWFD.
- 종양 조직의 준비
- 자궁 경부 탈구또는 IACUC 승인 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시하십시오.
- 10μm 크기의 메스를 사용하여 격리된 종양을 ~500-1,000 μm 두께로 슬라이스합니다.
- 37°C에서 37°C에서 40분 동안 마이크로센트심분리기 튜브에 100 μM NHF-ATP 및/또는 8 mg/mL H/LMWFD로 보충된 혈청없는 DMEM에서 종양 슬라이스를 배양하여 5%CO2 흐름을 갖는다.
참고: 잠복 후 종양 조직 대사로 인해 배지의 색상이 변경됩니다. - 37°C에서 조직을 헹구고 PBS(24웰 플레이트에서 각 헹구는 경우 2mL).
- 조직을 신선한 PBS를 곁들인 새로운 24웰 플레이트로 옮기고, 헹구고, 부드러운 흔들림으로 4회 반복합니다.
- 냉동 포함 (냉동 조직 블록 준비)
- 각 종양을 수확할 수 있도록 식별 라벨을 준비합니다. 실험실 테이프 의 2cm 조각을 잘라 반, 접착제 측면을 함께, 길이로 접습니다. 마킹 펜을 사용하여 마우스/종양 식별 번호와 같은 태그에 레이블을 지정합니다.
- 마른 얼음에 스테인레스 스틸 조직 금형을 직접 배치하여 내장 금형을 준비합니다.
참고: 드라이 아이스는 동상, 화상 및 질식을 일으킬 수 있습니다. 드라이 아이스를 다룰 때 절연 장갑을 착용하십시오. 통풍이 잘 되는 지역에서 드라이 아이스를 사용하십시오. 단단히 밀봉 된 용기에 드라이 아이스를 저장하지 마십시오. 대신 가스가 빠져나갈 수 있는 용기(예: 스티로폼 쿨러)에 보관하십시오. - 곰팡이가 오하는 동안, 10mm 조직 배양 판에 조직 동결 배지의 작은 풀을 놓습니다. 부피가 수확될 종양 조직을 침수하기에 충분합니다.
- 천공을 한 숟가락을 사용하여 절제된 종양 조직을 떠서 즉시 조직을 동결 배지에 배치하여 조직이 침수되도록 합니다. 천공 된 숟가락을 사용하여, 부드럽게 중간에 조직을 롤, 매체가 모든 조직 표면을 목욕하고 있는지 확인.
- 조심스럽게 동결 매체를 포함하는 포함 형질로 조직을 이동합니다. 해당 라벨 태그를 동결 매체/몰드에 수직으로 배치하여 제자리에 고정합니다. 작성된 레이블이 매체 외부에 표시되는지 확인합니다.
- 동결이 완료되면 (동결 매체는 불투명 하 게 회전), 금형에서 조직 블록을 제거, 건조 얼음에 배치, 각 종양에 대해 반복. 극저온 절제 절차 전에 몇 달 동안 -80 °C에 조직 블록을 저장합니다.
- 조직 샘플의 슬라이드 준비
- 내화 양성 세포를 찾아내고 더 대표적인 조직 영역을 갖는 기회를 극대화하기 위해- 냉동고를 사용하여 -18 ~ -20°C의 직렬 저온항을 수집한다.
- 프리칠 저온 공구(블레이드, 면도날, 안티롤 플레이트, 티슈 척 홀더, 페인트브러시)와 -18 ~20°C의 극저온 챔버에 배치하여 종양 조직 블록을 평형화한다. 블레이드 홀더 각도를 5-10°로 설정합니다. 필요에 따라 조직 블록을 면도날로 조심스럽게 다듬고 조직 동결 매체를 사용하여 척 홀더에 장착합니다.
- 척 홀더를 마이크로톤 유닛의 수직 위치에 잠그면 손 크랭크의 각 회전과 함께 설정된 거리(예: 10 μm)로 진행됩니다. 안티 롤 플레이트를 블레이드의 높이 바로 위에 놓습니다. 마이크로 톰을 진행하기 전에 조직 컬링을 방지하기 위해 조심스럽게 조직 블록의 하단 가장자리에 엄지 손가락을 밀어.
- 마이크로톤이 발전하고 조직 섹션이 금속 판에 떨어지면 페인트 브러시를 사용하여 조직 섹션을 안내하고 필요한 경우 조직을 풀수 있습니다.
- 섹션이 슬라이드에 끌릴 수 있도록 터치하지 않고 조직 섹션 위로 현미경 슬라이드를 마우스로 가져 갑니다.
참고: 극저온 블레이드(높은 프로필, 일회용)는 매우 날카롭고 심각한 부상을 입을 수 있습니다. 블레이드를 처리하고 극저온을 작동 할 때주의하십시오. 가능한 경우 블레이드 프로텍터를 사용하십시오. 적절한 훈련이 필요합니다. - 종양을 10 μm 두께의 부분으로 슬라이스합니다. 슬라이스된 부분을 양전하 유리 현미경 슬라이드로 즉시 전달합니다.
참고: 직렬 섹션의 경우 먼저 8개의 양전하 슬라이드의 왼쪽 위 모서리에 10 μm 두께의 섹션을 수집합니다. 조직의 후속 100-200 μm을 통해 저온을 진행하고 조직을 폐기하십시오. 슬라이스된 모든 섹션을 유리 현미경 슬라이드로 즉시 전달합니다. - 다음으로, 8개의 슬라이드 각각에 대해 이전에 배치된 조직 섹션 옆에 있는 또 다른 10 μm 두께 섹션을 수집합니다. 8개의 슬라이드각각에 각각 100-200 μm 간격으로 8개의 티슈 섹션이 포함될 때까지 이 직렬 수집 프로세스를 반복합니다. 형광을 보존하기 위해 어둠 속에서 조직 섹션을 유지합니다.
참고: 슬라이드의 조직 섹션은 몇 달 동안 -80°C의 슬라이드 박스에 저장할 수 있습니다.
- 내화 양성 세포를 찾아내고 더 대표적인 조직 영역을 갖는 기회를 극대화하기 위해- 냉동고를 사용하여 -18 ~ -20°C의 직렬 저온항을 수집한다.
- 조직 슬라이드의 고정
- 중요 단계: 조직 섹션을 -18 내지 -20°C에서 5분 동안 95% 에탄올로 수정합니다.
- 실온 PBS로 5분 동안 고정 된 섹션을 세척한 다음 DAPI를 사용하여 수성 장착 매체의 10 μL을 사용하여 유리 커버 슬립 아래에 고정 된 종양 섹션을 장착하십시오.
- 장착 후 12~24시간, 형광 현미경에 의한 고정 종양 섹션을 검사하고 위의 배양된 세포에 대해 설명된 바와 같이 이미지를 획득한다.
- 형광 현미경 검사및 이미지 수집
- 2.6항에 설명된 대로 관심 영역을 식별하고 이미지를 수집합니다.
- 데이터 정량화 및 분석
- 세포를 정량화하고 섹션 2.7에서와 같이 적절한 통계 분석을 적용합니다.
4. 종양의 ATP 내산화, 생체 내
- 섹션 3.1에 설명된 바와 같이 이식을 위한 세포 배양을 준비합니다.
- 이종이 이식 종양 개발을 위한 암세포의 피하 주입
- 섹션 3.2에 설명된 바와 같이 xenografted 종양을 생성합니다.
- 염기 이식 종양에 ATP 및/또는 dextran 주입
- DMEM의 NHF-ATP(100 μM) 유무에 관계없이 DMEM(차량) 또는 8mg/mL HMWFD 또는 LMWFD의 치료 솔루션을 준비한다.
- 1mL 주사기를 사용하여 1개의 치료 용액의 50 μL을 수집하고 각 xenograft 종양에 직접 용액을 주입합니다. 각 치료의 4개의 생물학적 복제에 대한 절차를 반복합니다.
- 조직 수확 및 저온 포함
- 각 종양을 수확할 수 있도록 식별 라벨을 준비합니다. 실험실 테이프 의 2cm 조각을 잘라 반, 접착제 측면을 함께, 길이로 접습니다. 마킹 펜을 사용하여 마우스/종양 식별 번호와 같은 태그에 레이블을 지정합니다.
- 약 5 분 후 주입, 자궁 경부 탈구또는 IACUC 승인 프로토콜에 따라 마우스를 안락사.
- 크기 10 메스를 사용하여, 종양에 인접한 절개를 하고 바늘 주입의 방향에 대략 수직으로 한다. 주변 조직에서 종양 조직을 절제하기 위해 집게와 외과 가위를 사용합니다.
- 종양을 총 종양 크기에 따라 2~4개 1cm2개로 나눕니다.
- 상기 섹션 3.6에 설명된 바와 같이 포함 금형을 준비하고 조직을 포함시킴을 포함시킴이 있다. 종양 내 주사에서 저온 포함에 이르기까지 수확 시간이 7-8 분 이상인지 확인하십시오.
- 조직 샘플의 슬라이드 준비
- 섹션 3.7에 설명된 바와 같이 직렬 종양 섹션을 수집합니다.
- 조직 슬라이드의 고정
- 3.8항에 설명된 바와 같이 조직을 수정한다.
- 형광 현미경 검사및 이미지 수집
- 2.6항에 설명된 대로 관심 영역을 식별하고 이미지를 수집합니다.
- 데이터 정량화 및 분석
- 2.7항에 설명된 바와 같이 세포를 정량화하고 적절한 통계 분석을 적용한다.
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Representative Results
시험관 내 연구
NHF-ATP의 세포 내산화는 HMWFD 또는 LMWFD(그림4)를가진 NHF-ATP의 공동 국소화에 의해 입증되었다. 이 절차의 성공은 주로 NHF-ATP 및 덱스트랜스의 적절한 농도의 사용과 덱스트랜스(폴리 리신 대 중립)의 적절한 유형(들)을 결정하는 데 의존합니다. 예를 들어, 매크로피노시토시스를 조사하기 위해 HMWFD는 매크로피노솜(13,14,15,16)에의해서만 내면화됨에 따라 선택되었다. 대안적으로, 클래트린 및/또는 카폴라 매개 내분비토가 연구되는 경우, LMWFD는 이러한 내세포증 관련 내분모의 작은 크기만 LMWFD14,15,16을삼키도록 허용하기 때문에 선택되어야 한다. 형광 덱스트랜스는 폴리 리신 드엑스트라안과 중성 덱스렌의 두 가지 형태로도 제공됩니다. 이러한 덱스트랜스는 서로 다른 형광 강도와 배경 염색을 생성합니다. 따라서 권장 응용 프로그램은 다양합니다. 예를 들어, 폴리 리신 드엑스트라엔은 더 높은 형광 강도뿐만 아니라 더 높은 배경을 생성합니다. 중성 덱스트랜스는 상대적으로 낮은 배경 신호로 충분한 형광 강도를 생성하며 암 세포주를 이용한 실험에 바람직하다. 이 비용 효율적인 분석기를 사용하여, 우리는 고강도 및 고신호 -투- 잡음 NHF-ATP 형광 라벨링을 생성, 이는 혼란 배경 형광없이 덱스트랜스의 형광 강도와 일치.
고정제 및 고정 절차의 선택이 분석의 결과에 크게 영향을 미쳤기 때문에 고정 조건은 각 특정 실험(즉, 특정 세포주 또는 조직 유형)에 대해 실험적으로 결정되고 선택되어야 합니다. 세포 외 ATP는 분석에서 필요하지 않습니다; 사실, 분석 용액에서 eATP의 고농도는 증가 배경으로 이어질 수 있습니다. 중요 하게, 세포 파종 후, 혈청 기아에 대 한 최적의 시간 프레임은 ~15-18 h. 혈청 기아가 너무 길면 영양소가 부족하면 세포 부착에 영향을 미치고 다음 단계에서 세포의 손실로 이어질 수 있습니다. 혈청 기아가 너무 짧으면 세포 주기가 제대로 체포되지 않으며 핵 염색은 슬라이드를 가로 질러 균일하지 않습니다. 따뜻한 PBS에서 커버슬립 바운드 조직을 5번 헹구는 것은 배경 염색을 제거하기에 충분합니다. 조직 세정으로 매우 부드러운 것이 중요합니다. 과도한 헹구기, 차가운 헹구기 또는 강제 세척을 피하십시오.
어떤 암 세포주든이 분석에서 사용될 수 있는 동안, 다른 세포주 내산화의 다른 정도를 보여줄 수 있습니다. 우리는 KRAS 프로토 온코진 돌연변이를 가진 암 세포가 NHF-ATP 내산화를 연구하기 위해 유리하다는 것을 보여주었습니다. KRAS 돌연변이는 eATP의 내화에 필요하지 않지만, KRAS 돌연변이는 시험관내의증가된 대식세포증과 연관된다. 이러한 실험을 위해, 우리는 KRAS 돌연변이를 품고 있는 A549 폐암 세포를 선택했습니다. 실제로, A549 세포에서 eATP의 대식세포증은 이전에 시험관내 ATP 내산화분석(13)을사용하여 나타내고 있다.
엑스 비보 연구
도 5는 종양 조직 섹션에서 NHF-ATP 내재화의 형광 현미경 이미지를 나타낸다. 전 생체 내 연구의 성공은 종양 조직과 종양 섹션의 철저한 사후 수집 세척으로 NHF-ATP의 적절한 배양에 크게 의존한다. 잠복기 시간이 짧거나 길면 내산화가 중단될 수 있습니다. 다른 종양에 대한 배양 시간을 실험적으로 그리고 사전에 결정합니다. 종양 조직의 부적절한 헹구는 것은 높은 배경 염색을 허용하고 따라서 낮은 신호 대 잡음 비율을 허용합니다.
고정 에이전트의 선택도 중요합니다. 메탄올, 포름알데히드, 아세톤 및 에탄올의 고정은 개별적으로 테스트할 수 있으며 특정 연구 시스템에 가장 적합한 고정제를 식별하기 위해 비교할 수 있습니다. 장착된 슬라이드는 내부형 형광 분자가 세포에서 방출되고 높은 배경에 기여하는 것을 막기 위해 12-24 h 이내에 촬영해야 하지만 더 이상 촬영되어야 한다는 점은 주목할 만합니다. 마지막으로, 종양 조직 섹션의 가장자리에서 에지 효과 현상-강렬한 염색을 피하기 위해-그것은 전 생체 내 분비 전에 균일 한 조직 섹션을 수집 하는 것이 중요 하다.
종양 조직의 이질성을 감안할 때 종양 전체에 조직 섹션을 얻는 것이 중요합니다. 100-200 μm 간격으로 취한 직렬 종양 섹션을 수집하는 설명된 방법은 종양의 상이한 영역에서 대표적인 데이터를 획득 및 분석할 수 있도록 보장한다. 예를 들면, 다른 종양 모형이 다른 ATP 내산화 데이터를 생성할 수 있는 것처럼, 종양 내 지역을 선택하는 것은 또한 ATP 내분화 운동 및 기계장치에 변화할 수 있습니다.
생체 내 연구
도 6은 주입된 종양(xenografted) 종양에서 NHF-ATP 내재화를 나타낸다. 생체 내 연구에서 성공적이고 긍정적인 매개 변수는 NHF-ATP 주입과 주사와 동물 안락사 사이의 시간이었습니다. 주사 시술 시술 동안, 주사 바늘을 가능한 한 많은 종양 영역에 도달하도록 배치하고, NHF-ATP가 종양 내부에 남아 있고 누출되지 않도록 1 분 동안 종양 내에서 바늘을 그대로 유지합니다. 주사와 안락사 사이의 짧은 시간 간격은 주입 된 NHF-ATP가 종양 세포로 이송되는 것을 보장하지만, 그 수송은 너무 길지 않아 받는 세포가 NHF-ATP를 크게 대사하고 저하시키지 않아 세포 내 얼룩이 발생합니다. 안락사 및 종양 제거 후, 각 종양에 대한 주사 절차를 문서화, 주사 부위 및 주사 방향을 포함. 이러한 방식으로 종양은 특정 방향과 특정 해부학 평면을 따라 단면하여 종양 단면도가 주입 방향에 평행하게 실행되어 더 많은 NHF-ATP 양성 세포의 식별으로 이어질 수 있습니다.
그림 4: A549 세포는 시험관내HMWFD와 공동 국소화되는 NHF-ATP를 내면화한다. 1 mg/mL HMWFD(왼쪽 패널, 빨간색) 및 10μM NHF-ATP(중간 패널, 녹색)로 배양된 A549 세포의 형광 현미경 검사는 30분 동안. Inset은 박스에 있는 영역의 높은 배율을 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어: NHF-ATP = 비수성 형광 ATP; HMWFD = 고분자 량 형광 드엑스트라른. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: A549 세포는 HMWFD ex vivo와함께 NHF-ATP를 내면화한다. 종양성 A549 세포의 형광 현미경 검사는 면역 결핍(Nu/J)마우스로 이식; NHF-ATP 내재화는 전비보를수행했다. 외과적으로 제거된 종양은 8mg/mL HMWFD(왼쪽 패널, 빨간색) 및 100 μM NHF-ATP(중간 패널, 녹색)로 인큐베이션되었다. 셀룰러 HMWFD 및 NHF-ATP의 공동 지역화는 병합된 이미지(오른쪽 패널, 노란색)로 표시됩니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어: NHF-ATP = 비수성 형광 ATP; HMWFD = 고분자 량 형광 드엑스트라른. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: A549 세포는 생체 내에서HMWFD와 함께 NHF-ATP를 내면화한다. 종양성 A549 세포의 형광 현미경 검사법,면역결핍(Nu/J)마우스로 이식된 이종이소; NHF-ATP 내산화는 살아있는 마우스의 종양으로 직접 주입되는 8 mg/mL HMWFD 및 100 μM NHF-ATP를 가진 생체 내에서 수행되었다. 셀룰러 HMWFD 및 NHF-ATP의 공동 지역화는 A 및 B(오른쪽 패널, 노란색)에서 병합된 이미지로 표시됩니다. (A)고배율 이미지는 생체 내 종양에서NHF-ATP 및 HMWFD의 세포 내재화를 강조한다. 스케일 바 = 20 μm.(B)저배율 이미지는 종양 조직 섹션 내의 지역 내재화를 묘사합니다. 스케일 바 = 100 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
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Discussion
비수성 ATP의 세포 내산화의 공간적, 시간적 및 정량적 분석을 위해 개발되었다. 이 방법은 기술 교육 및 대표 데이터를 제공하는 다양한 종양 유발 모델을 포함한 다양한 생물학적 시스템에서 사용하기 에 광범위하게 적용됩니다. 생체 내 ATP 내재화 연구(프로토콜의 섹션 4)에서 해석 가능한 데이터를 획득하려면 종양 내 주사에서 극저온-포함으로 경과된 실험 시간을 제한하는 것이 중요합니다. 조직 슬라이드 후 종양 절개 고정 -형광 현미경 이미징 전에 필요한 단계입니다. 함께, 이 2개의 중요한 단계는 종양 세포가 화상 진찰 과정 도중 내재된 ATP를 유지한다는 것을 확인합니다. ATP 내재화 분석 중 또 다른 중요한 고려 사항은 이종 이식 종양의 이질성을 설명하는 것입니다. 종양 발생이 암세포 유형 중 다르게 진행됨에 따라, 다른 암세포에 대한 이상적인 실험 조건을 결정하기 위해이 방법의 측면을 해결하는 것이 필요할 수 있습니다. 종양에서 ATP의 대식세포증에 대한 포괄적인 평가를 보장하기 위해서는 상주 세포 와 eATP를 내면화하는 능력에 있어 지역적 변화가 있을 수 있으므로 종양 전체의 조직 섹션을 이미지화하는 것이 중요합니다. 실제로, 이 방법은 향후 연구에서 암/종양 세포 중 eATP 내산화의 다른 메커니즘을 발견할 수 있다.
NHF-ATP는 내재 연구를 위해 공관되지 않은 ATP 또는 방사성 ATP만 대체할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. NHF-ATP가 세포 내부의 거시피노좀 및/또는 내분술에서 방출되면 다르게 대사될 것이기 때문에 대사 연구와 같은 다른 연구에 사용할 수 없습니다. 전통적으로 ATP 내산화는 방사성 ATP17,18,19를사용하여 조사되었다. 그러나, 방사성 ATP의 불안정성을 감안할 때, 표적 세포 내부의 측정 가능한 방사능은 반드시 ATP를 손상시키지 않습니다. NHF-ATP는 가수분해성이 없으며 현미경으로 시각화할 수 있기 때문에 방사성 ATP보다 사용이 권장됩니다.
본 명세서에 기재된 절차는 간단하고, 빠르고, 비용 효율적입니다. 이미징 시스템에 향후 응용 프로그램에서 비디오 기능이 장착된 경우 ATP 내재화의 동적 프로세스를 실시간으로 시각화하여 특정 조직에서 거시성 역학 및 인신 매매에 대한 정보를 공개할 수 있습니다. 이 절차는 H1299세포(12)및 NL-20세포(12)및 뉴런 세포와 같은 비암성 세포와 같은 다른 암세포주에서 성공적으로 사용되었으며, 그 또는 경미한 변형(데이터가 표시되지 않음). ATP는 암 대사6,7, 8,20,21,22,당뇨병23,24,25및 에너지 대사와 관련된 기타 질병에 바르부르크 효과에 밀접하게 관여하고 있으며, eATP가 이러한 질병에 중요한 역할을 할 수 있기 때문에, 기술된 절차는 광범위한 적용을 할 가능성이 높다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저온절균은 오하이오 대학 조직 병리학 코어에서 현장에서 수행되었습니다. 이 작품은 C 닐슨에 창업 기금 (오하이오 대학 예술 과학 대학)에 의해 부분적으로 지원되었다; NIH는 R15 CA242177-01 및 RSAC 상을 X Chen에 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker - orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical - sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
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