मानव ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर-विद्वेष चूहों में मैक्रोपिनोसाइटोसिस द्वारा मध्यस्थता एटीपी आंतरिकता के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी
Summary
हमने उच्च सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ नॉनहिड्रोलाइजेबल फ्लोरोसेंट एडेनोसिन ट्राइफोस्फेट (एटीपी), एटीपी सरोगेट के आंतरिककरण की कल्पना करने के लिए एक प्रजनन योग्य विधि विकसित की है। हमने स्वतंत्र इन विट्रो और वीवो परख-मानव ट्यूमर सेल लाइनों और इम्यूनोडिफिशिएंसी चूहों का उपयोग करके हमारी विधि को मान्य किया जो मानव ट्यूमर ऊतक के साथ विद्वेष है।
Abstract
एक्सट्रासेलुलर एटीपी (ईटीएपी) सहित एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) को ट्यूमरिजेनेसिस के विभिन्न पहलुओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है, जैसे ड्रग रेजिस्टेंस, एपिथेलियल-मेसेन्चिमल ट्रांजिशन (ईएमटी), और मेटास्टेसिस । इंट्राट्यूमोरल ईएटीपी सामान्य ऊतकों की तुलना में एकाग्रता में 103 से10 4 गुना अधिक है। जबकि ईएमटी इंडक्शन के लिए प्यूरिनेर्गिक सिग्नलिंग को सक्रिय करने के लिए ईएटीपी एक मैसेंजर के रूप में कार्य करता है, यह विभिन्न प्रकार के जैविक कार्यों को करने के लिए एक विशिष्ट प्रकार के एंडोसाइटोसिस, अपविबंधीय मैक्रोपिनोसाइटोसिस के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं द्वारा भी आंतरिक है। इन कार्यों में एटीपी-आवश्यकता वाले जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं को ऊर्जा प्रदान करना, सिग्नल ट्रांसडक्शन के दौरान फॉस्फेट समूहों को दान करना, और ट्रांसक्रिप्शनल कोफैक्टर के रूप में जीन अभिव्यक्ति को सुविधाजनक या तेज करना शामिल है । एटीपी आसानी से उपलब्ध है, और कैंसर और अन्य क्षेत्रों में इसका अध्ययन निस्संदेह बढ़ेगा। हालांकि, eATP अध्ययन एक प्रारंभिक चरण में रहता है, और अनसुलझे सवालों के महत्वपूर्ण और बहुमुखी EATP और आंतरिक इंट्रासेलुलर एटीपी द्वारा निभाई गतिविधियों से पहले अनुत्तरित रहते है पूरी तरह से सुलझाया जा सकता है ।
इन शुरुआती ईएटीपी अध्ययनों में इन लेखकों के प्रयोगशालाओं के योगदान में गैर-हाइड्रोलिस्टेबल फ्लोरोसेंट एटीपी की सूक्ष्म इमेजिंग शामिल है, जो उच्च और कम आणविक वजन फ्लोरोसेंट डेक्सट्रांस के साथ मिलकर है, जो मैक्रोपिनोसाइटोसिस और एंडोसाइटोसिस ट्रेसर्स के साथ-साथ विभिन्न एंडोसाइटोसिस अवरोधकों की निगरानी और विशेषता के रूप में काम करता है। इस इमेजिंग मोडलिटी ट्यूमर सेल लाइनों के लिए और इम्यूनोडिरेट चूहों के लिए लागू किया गया था, मानव कैंसर ट्यूमर के साथ xenografted, vitro में और वीवो मेंeATP आंतरिककरण का अध्ययन करने के लिए । यह पत्र इन इन विट्रो और वीवो प्रोटोकॉल में वर्णन करता है, जिसमें परख की स्थिति को संशोधित और महीन करने पर जोर दिया जाता है ताकि मैक्रोपिनोसाइटोसिस-/एंडोसाइटोसिस-मध्यस्थता ईएटीपी आंतरिककरण परख सफलतापूर्वक विभिन्न प्रणालियों में किया जा सके ।
Introduction
इंट्राट्यूमोरल एक्स्ट्रासेलुलर (यानी) पोषक तत्वों के अवसरवादी तेज को हाल ही में कैंसर मेटाबोलिज्म के लिए एक प्रमुख पहचान का नाम दिया गया है1। इन महत्वपूर्ण पोषक तत्वों में से एक एटीपी है, क्योंकि ieATP की एकाग्रता सामान्य ऊतकों में पाए जाने वाले सामान्य ऊतकों की तुलना में 103 और 104 गुना अधिक है, जो कई सौ माइक्रोन सेकम एमएमएम2,3,4,5की सीमा में है। एक प्रमुख ऊर्जा और संकेत अणु के रूप में, एटीपी कैंसर और स्वस्थ कोशिकाओं में सेलुलर चयापचय में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है6,7,8। एक्स्ट्रासेलुलर एटीपी न केवल कैंसर सेल ग्रोथ में शामिल है, बल्कि यह ड्रग रेजिस्टेंस9को भी बढ़ावा देता है । हाइड्रोट्रोपिक गतिविधि जैसे एटीपी के पहले अपरिचित कार्यों की हाल ही में पहचान की गई है, इस प्रकारअल्जाइमर 10जैसे रोगों में एटीपी की भागीदारी को फंसाने । दरअसल, यह एटीपी और कैंसर की कोशिकाओं, स्वस्थ कोशिकाओं, और अन्य रोगग्रस्त कोशिकाओं में अपने कार्यों के बारे में हमारी समझ लगता है पूरा से दूर है । हालांकि, एटीपी की अस्थिरता और कोशिकाओं में उच्च कारोबार दरों के कारण, कोशिका झिल्ली में और सेल में एटीपी के आंदोलन की निगरानी करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है।
इस समस्या को दूर करने और इस अनुसंधान क्षेत्र की आवश्यकता को भरने के लिए, एक विधि विकसित की गई थी जिसमें नॉनहिड्रोलिजेबल फ्लोरोसेंट एटीपी (एनएचएफ-एटीपी)(चित्रा 1)का उपयोग एटीपी के आंतरिककरण की कल्पना करने और आंतरिक एटीपी के इंट्रासेलर स्थानिक स्थानीयकरण का निरीक्षण करने के लिए एक किराए के रूप में किया गया था, दोनों विट्रो में और वीवो11,12 में . कैंसर सेल लाइनों में और मानव ट्यूमर ऊतक में इम्यूनोडिडेंट चूहों11,12पर xenografted दोनों में एटीपी आंदोलन की जांच करने के लिए अंतर्जात एटीपीकेलिए स्थानापन्न करने के लिए एनएचएफ-एटीपी का प्रदर्शन किया गया है । इसके अलावा, कोशिकाओं को मैक्रोपिनोसाइटोसिस अवरोधकों का प्रशासन करते हुए ईएटीपी आंतरिककरण को अवरुद्ध कर दिया, जिससे यह सुझाव दिया गया कि ईएटीपी के इंट्रासेलुलर तेज में मैक्रोपिनोसाइटोटिक तंत्र9,11,12शामिल है। यह प्रोटोकॉल कोशिका-विशिष्ट प्रोटीन के खिलाफ इम्यूनोबेस्ड कोलबेलिंग की अनुमति देता है और इस प्रकार किस सेल प्रकार की पहचान एनएचएफ-एटीपी को आंतरिक बनाता है। वीवो ट्यूमर ज़ेनोग्राफ़ और उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी में उपयोग करना, एनएचएफ-एटीपी को ऊतक नमूने में और यहां तक कि एक सेल के भीतर भी स्थानिक रूप से कल्पना की जा सकती है। ये विधियां मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति भी देती हैं, जैसे सेलुलर तेज का प्रतिशत, मैक्रोपिनोसाइटोटिक वेसिकल्स की संख्या, और आंतरिककरण काइनेटिक्स। इस पत्र में विस्तार से वर्णन किया गया है कि कैसे एनएचएफ-एटीपी, अकेले काम कर रहे हैं या एंडोसाइटोसिस-ट्रेसर फ्लोरोसेंट डेक्सट्रांस13,14, 15,16के साथ काम करतेहैं,का उपयोग कोशिकाओं में आंतरिककरण के बाद एटीपी के आंतरिककरण और इंट्रासेलुलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स में किया जा सकता है।
चित्रा 1:नॉनहाइड्रोलिजेबल फ्लोरोसेंट एटीपी और टेट्रामेथाइलरोडमाइन की संरचनाएं उच्च आणविक वजन फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान लेबल। (ख)एचएमडब्ल्यूएफडी का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। संक्षिप्त: एटीपी = एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट; एनएचएफ-एटीपी = नॉनहिड्रोलाइजेबल फ्लोरोसेंट एटीपी; टीएमआर = टेट्रामेथाइलरोडमाइन; एचएमडब्ल्यूएफडी = उच्च आणविक वजन फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Protocol
Representative Results
Discussion
नॉनहिड्रोलाइजेबल एटीपी के सेलुलर आंतरिककरण के स्थानिक, लौकिक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि विकसित की गई थी। यह विधि विभिन्न ट्यूमरजनक मॉडलों सहित विविध जैविक प्रणालियों में उपयोग के लिए मोट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
क्रायोसेक्शनिंग ओहियो विश्वविद्यालय हिस्टोपैथोलॉजी कोर में साइट पर किया गया था । इस काम को आंशिक रूप से स्टार्ट-अप फंड्स (ओहियो यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ आर्ट्स एंड साइंसेज) से सी नीलसन को समर्थन दिया गया था; एनआईएच ग्रांट R15 CA242177-01 और आरएसएसी पुरस्कार एक्स चेन को ।
Materials
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker – orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical – sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
- Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008 (2008).
- Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101 (2013).
- Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
- Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).
- Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
- Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
- Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
- Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
- Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
- Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
- Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
- Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
- Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
- Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
- Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
- Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
- Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154 (2007).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
