Microscopie à fluorescence pour l’internalisation de l’ATP médiée par la macropinocytose dans les cellules tumorales humaines et les souris xénogreffées

Summary

Nous avons développé une méthode reproductible pour visualiser l’internalisation de l’adénosine triphosphate fluorescente non hydrolysable (ATP), un substitut de l’ATP, avec une résolution cellulaire élevée. Nous avons validé notre méthode en utilisant des tests indépendants in vitro et in vivo - des lignées de cellules tumorales humaines et des souris immunodéficientes xénogreffées avec du tissu tumoral humain.

Abstract

Il a été démontré que l’adénosine triphosphate (ATP), y compris l’ATP extracellulaire (eATP), joue un rôle important dans divers aspects de la tumorigenèse, tels que la résistance aux médicaments, la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et les métastases. L’eATP intratumoral est 10 à 10⁴ fois plus élevée en concentration que dans les tissus normaux. Alors que l’eATP fonctionne comme un messager pour activer la signalisation purinergique pour l’induction EMT, il est également internalisé par les cellules cancéreuses par macropinocytose régulée à la hausse, un type spécifique d’endocytose, pour effectuer une grande variété de fonctions biologiques. Ces fonctions comprennent la fourniture d’énergie aux réactions biochimiques nécessitant de l’ATP, le don de groupes phosphate pendant la transduction du signal et la facilitation ou l’accélération de l’expression des gènes en tant que cofacteur transcriptionnel. L’ATP est facilement disponible, et son étude dans le cancer et d’autres domaines augmentera sans aucun doute. Cependant, l’étude eATP en est encore à un stade précoce et les questions non résolues restent sans réponse avant que les activités importantes et polyvalentes de l’eATP et de l’ATP intracellulaire internalisé puissent être complètement démêlées.

Les contributions des laboratoires de ces auteurs à ces premières études eATP comprennent l’imagerie microscopique de l’ATP fluorescent non hydrolysable, associée à un dextrans fluorescent de haut et de bas poids moléculaire, qui sert de traceurs de macropinocytose et d’endocytose, ainsi que divers inhibiteurs de l’endocytose, pour surveiller et caractériser le processus d’internalisation de l’eATP. Cette modalité d’imagerie a été appliquée à des lignées cellulaires tumorales et à des souris immunodéficientes, xénogreffées avec des tumeurs cancéreuses humaines, pour étudier l’internalisation de l’eATP in vitro et in vivo. Cet article décrit ces protocoles in vitro et in vivo, en mettant l’accent sur la modification et l’ajustement des conditions de dosage afin que les tests d’internalisation de l’eATP médiés par la macropinocytose / endocytose puissent être effectués avec succès dans différents systèmes.

Introduction

L’absorption opportuniste des nutriments extracellulaires intratumoraux (c’est-à-dire) a récemment été nommée une marque clé du métabolisme du cancer¹. L’un de ces nutriments importants est l’ATP, car la concentration d’ieATP est 10³ et^{10 4} fois plus élevée que celle trouvée dans les tissus normaux, dans la gamme de plusieurs centaines de μM à faible mM^2,3,4,5. En tant que molécule clé d’énergie et de signalisation, l’ATP joue un rôle central dans le métabolisme cellulaire dans les cellules cancé....

Protocol

Toutes les procédures rapportées ici ont été effectuées conformément à l’IACUC de l’Université de l’Ohio et au NIH.

1. Sélection de l’ATP fluorescent non hydrolysable (NHF-ATP) et du dextrans

1. Sélectionner un NHF-ATP conjugué au fluorophore(Figure 1A)et des traceurs d’endocytose, un dextrans fluorescent de haut et de bas poids moléculaire (TMR-HMWFD et TMR-LMWFD)(Figure 1B),en fonction des longueurs d’onde d’émission préférées (p. ex., système d’imagerie équipé de filtres appropriés) et du processus d’endocytose spécifique à étudier.

2. Étud....

Results

Étude in vitro
L’internalisation intracellulaire de NHF-ATP a été démontrée par colocalisation de NHF-ATP avec HMWFD ou LMWFD (Figure 4). Le succès de cette procédure repose principalement sur l’utilisation de concentrations appropriées de NHF-ATP et de dextrans et sur la détermination du ou des types appropriés de dextrans (poly-lysine vs neutre). Par exemple, pour étudier la macropinocytose, HMWFD a été choisi car il n’est internalisé que par.......

Discussion

Une méthode a été développée pour l’analyse spatiale, temporelle et quantitative de l’internalisation cellulaire de l’ATP non hydrolysable. Cette méthode est largement applicable pour une utilisation dans divers systèmes biologiques, y compris divers modèles tumorigènes, pour lesquels nous fournissons des instructions techniques et des données représentatives. Pour acquérir des données interprétables lors d’études in vivo d’internalisation de l’ATP (section 4 du protocole), il est essentiel de limiter le temps e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellules A549, épithéliale pulmonaire humain, carcinome	National Cancer Institute	n/a	Source moins chère
Acétone	Fisher Scientific	S25904
Feuille d’aluminium, Reynolds	Grainger	6CHG6
Milieu de montage aqueux, ProLong Gold Réactif anti-décoloration	ThermoFisher	P36930
ATP analogue	Jena Biosciences	NK-101
Autoclave, stérilisateur	Grainger	33ZZ40
Lames, cryostat, profil haut C	. L. Sturkey, Inc.
Pied à coulisse, vernier	Grainger	4KU77
Milieu cellulaire, mélange nutritif de jambon F12, sans sérum	Millipore Sigma	51651C-1000ML
Centrifugeuse, réfrigérée avec rotor à godet oscillant	Eppendorf	5810R
Chloroforme	Acros Organics	423555000
Tube conique, 15 mL	VWR	21008-216
Tube conique, 50 mL	VWR	21008-242
Lamelles, verre, 12 mm	Corning	2975-245
Cryostat, Leica CM1950	Leica Biosystems	CM1950
Lingette délicate, Kim Wipes	Kimberly-Clark	34155
Dextran, fixable à la lysine, poids moléculaire élevé (HMW)	Invitrogen	D1818	MW = 70 000, tétraméthylrhodamine
dextran, neutre, poids moléculaire élevé (HMW)	Invitrogen	D1819
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), sans sérum	Fisher Scientific	11885076
Glace carbonique	Livraison locale Commande
Système d’imagerie épifluorescente, logiciel d’acquisition Nikon NiU et Nikon NIS Elements		NikonEthanol
	Fisher Scientific	BP2818-4
Sérum de veau fœtal (FBS)	ThermoFisher	16000044
Forceps, Dumont #7, incurvé	Fine Science Tools	11274-20
Forceps, Dumont #5, droit	Fine Science Tools	11254-20
Gants (petit, moyen, grand)	Microflex	N191, N192, N193
Gants, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (pour la manipulation de la glace carbonique)	Fisher Scientific	19-046-563
Hémocytomètre	Daigger	EF16034F EA
Incubateur, culture cellulaire	Eppendorf	Galaxy 170 S
Ruban d’étiquetage	Fisher Scientific	159015R
Stylo de marquage, Sharpie (ultra-fin)	Agrafes
Souris immunodéficientes (Nu/J)	Jackson Laboratory	2019
Microcentrifugeuse, accuSpin Micro17	Fisher Scientific	13-100-675
Tubes microcentrifuges, tubes Eppendorf (1,5 mL)	Axygen	MCT-150-C
Boîte à lames de microscope	Fisher Scientific	50-751-4983
Aiguille, calibre	27Becton-Dickinson	752 0071
Pinceau	Grainger	39AL12
Essuie-tout	Agrafes	33550
Paraformaldéhyde	Acros Organics	416785000
Pénicilline/Streptomycine	Gibco	15140122
Cuillère perforée, 15 mm de diamètre, 135 mm de longueur	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6162
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Fisher Scientific	BP3991
Pointes de pipette (10 &mu ; L)	Fisher Scientific	02-707-438
Pointes de pipette (200 &mu ; L)	Fisher Scientific	02-707-411
Pointes de pipette (1000 &mu ; L)	Fisher Scientific	02-707-403
Pipettes sérologiques (10 mL)	VWR	89130-910
Pippetor, Gilson P2	Daigger	EF9930A
Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 &mu ; L, 20-200 &mu ; L, 200-1000 &mu ; L)	Daigger	EF9931A
Agitateur de plate-forme - orbital, de paillasse	Cole-Parmer	EW-51710-23
Lames de microscope à charge positive, Superfrost	Fisher Scientific	12-550-15
Scalpel, taille 10, Surgical Design, Inc.	Fisher Scientific	22-079-707
Ciseaux chirurgicaux - tranchants, courbes	Outils pour les sciences fines	14005-12
Logiciel pour l’analyse d’images, Nikon Elements	Nikon	Commande
Logiciel pour l’analyse d’images, ImageJ (FIJI)	National Institutes of Health	n/a	Télécharger en ligne (gratuit)
30 mm (support de mandrin), accessoire pour cryostat	Leica Biosystems	14047740044
Plateau de coloration, 245 mm Plat BioAssay Seringue	Corning	431111
1 cc	Becton-Dickinson
Ruban, laboratoire, largeur 19 mm	Fisher Scientific	15-901-5R
Minuterie	Fisher Scientific	14-649-17
Plat de culture tissulaire, 100 x 15 mm de diamètre	Fisher Scientific	08-757-100D
Flacon de culture tissulaire, 225 cm2	ThermoFisher	159933
Plaque de culture tissulaire, 24 puits	Becton-Dickinson	353226
Moule d’enrobage tissulaire, acier inoxydable	Tissue Tek	4161
Medium de congélation tissulaire, température de coupe optimale (OCT)	Fisher Scientific	4585
Trypsine-EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique), 0,25 %Bain-marie	Gibco	25200072
, Precision GP 2S	ThermoFisher	TSGP2S