Microscopie à fluorescence pour l’internalisation de l’ATP médiée par la macropinocytose dans les cellules tumorales humaines et les souris xénogreffées
Summary
Nous avons développé une méthode reproductible pour visualiser l’internalisation de l’adénosine triphosphate fluorescente non hydrolysable (ATP), un substitut de l’ATP, avec une résolution cellulaire élevée. Nous avons validé notre méthode en utilisant des tests indépendants in vitro et in vivo – des lignées de cellules tumorales humaines et des souris immunodéficientes xénogreffées avec du tissu tumoral humain.
Abstract
Il a été démontré que l’adénosine triphosphate (ATP), y compris l’ATP extracellulaire (eATP), joue un rôle important dans divers aspects de la tumorigenèse, tels que la résistance aux médicaments, la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et les métastases. L’eATP intratumoral est 10 à 104 fois plus élevée en concentration que dans les tissus normaux. Alors que l’eATP fonctionne comme un messager pour activer la signalisation purinergique pour l’induction EMT, il est également internalisé par les cellules cancéreuses par macropinocytose régulée à la hausse, un type spécifique d’endocytose, pour effectuer une grande variété de fonctions biologiques. Ces fonctions comprennent la fourniture d’énergie aux réactions biochimiques nécessitant de l’ATP, le don de groupes phosphate pendant la transduction du signal et la facilitation ou l’accélération de l’expression des gènes en tant que cofacteur transcriptionnel. L’ATP est facilement disponible, et son étude dans le cancer et d’autres domaines augmentera sans aucun doute. Cependant, l’étude eATP en est encore à un stade précoce et les questions non résolues restent sans réponse avant que les activités importantes et polyvalentes de l’eATP et de l’ATP intracellulaire internalisé puissent être complètement démêlées.
Les contributions des laboratoires de ces auteurs à ces premières études eATP comprennent l’imagerie microscopique de l’ATP fluorescent non hydrolysable, associée à un dextrans fluorescent de haut et de bas poids moléculaire, qui sert de traceurs de macropinocytose et d’endocytose, ainsi que divers inhibiteurs de l’endocytose, pour surveiller et caractériser le processus d’internalisation de l’eATP. Cette modalité d’imagerie a été appliquée à des lignées cellulaires tumorales et à des souris immunodéficientes, xénogreffées avec des tumeurs cancéreuses humaines, pour étudier l’internalisation de l’eATP in vitro et in vivo. Cet article décrit ces protocoles in vitro et in vivo, en mettant l’accent sur la modification et l’ajustement des conditions de dosage afin que les tests d’internalisation de l’eATP médiés par la macropinocytose / endocytose puissent être effectués avec succès dans différents systèmes.
Introduction
L’absorption opportuniste des nutriments extracellulaires intratumoraux (c’est-à-dire) a récemment été nommée une marque clé du métabolisme du cancer1. L’un de ces nutriments importants est l’ATP, car la concentration d’ieATP est 103 et10 4 fois plus élevée que celle trouvée dans les tissus normaux, dans la gamme de plusieurs centaines de μM à faible mM2,3,4,5. En tant que molécule clé d’énergie et de signalisation, l’ATP joue un rôle central dans le métabolisme cellulaire dans les cellules cancéreuses et saines6,7,8. L’ATP extracellulaire n’est pas seulement impliqué dans la croissance des cellules cancéreuses, mais il favorise également la résistance aux médicaments9. Des fonctions auparavant non reconnues de l’ATP, telles que l’activité hydrotrope, ont récemment été identifiées, impliquant ainsi l’implication de l’ATP dans des maladies telles que la maladie d’Alzheimer10. En effet, il semble que notre compréhension de l’ATP et de ses fonctions dans les cellules cancéreuses, les cellules saines et d’autres cellules malades soit loin d’être complète. Cependant, en raison de l’instabilité de l’ATP et des taux de renouvellement élevés dans les cellules, il est techniquement difficile de surveiller le mouvement de l’ATP à travers la membrane cellulaire et dans la cellule.
Pour résoudre ce problème et répondre au besoin de ce domaine de recherche, une méthode a été développée dans laquelle l’ATP fluorescent non hydrolysable (NHF-ATP)(Figure 1)a été utilisé comme substitut pour visualiser l’internalisation de l’ATP et observer la localisation spatiale intracellulaire de l’ATP internalisé, à la fois in vitro et in vivo11,12 . Il a été démontré que le NHF-ATP remplace l’ATP endogène pour étudier le mouvement de l’ATP à travers les membranes cellulaires animales, à la fois dans les lignées cellulaires cancéreuses et dans les tissus tumoraux humains xénogreffés sur des souris immunodéficientes11,12. De plus, l’administration d’inhibiteurs de la macropinocytose aux cellules a bloqué l’internalisation de l’eATP, suggérant que l’absorption intracellulaire de l’eATP implique un mécanisme macropinocytotique9,11,12. Ce protocole permet le comarquage immunosourcé contre des protéines spécifiques à la cellule et donc l’identification du type de cellule qui internalise le NHF-ATP. En utilisant des xénogreffes tumorales in vivo et la microscopie à haute résolution, le NHF-ATP peut être visualisé spatialement à travers l’échantillon de tissu et même dans une seule cellule. Ces méthodes permettent également une analyse quantitative, telle que le pourcentage d’absorption cellulaire, le nombre de vésicules macropinocytotiques et la cinétique d’internalisation. Cet article décrit en détail comment le NHF-ATP, travaillant seul ou avec le dextrans fluorescent dextrans13 , 14 , 15,16, peut être utilisé dans différents contextes expérimentaux pour étudier l’internalisation et la localisation intracellulaire de l’ATP, après l’internalisation dans les cellules.
Figure 1: Structures de l’ATP fluorescent non hydrolysable et de la tétraméthylrhodamine marquées de dextran fluorescent de haut poids moléculaire. (A) Structure de NHF-ATP. (B) Représentation schématique du HMWFD. Abréviations : ATP = adénosine triphosphate; NHF-ATP = ATP fluorescent non hydrolysable; TMR = tétraméthylrhodamine; HMWFD = dextran fluorescent de haut poids moléculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une méthode a été développée pour l’analyse spatiale, temporelle et quantitative de l’internalisation cellulaire de l’ATP non hydrolysable. Cette méthode est largement applicable pour une utilisation dans divers systèmes biologiques, y compris divers modèles tumorigènes, pour lesquels nous fournissons des instructions techniques et des données représentatives. Pour acquérir des données interprétables lors d’études in vivo d’internalisation de l’ATP (section 4 du protocole), il est esse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La cryosection a été réalisée sur place au ohio University Histopathology Core. Ce travail a été soutenu en partie par des fonds de démarrage (Ohio University College of Arts & Sciences) à C Nielsen; Subvention NIH R15 CA242177-01 et prix RSAC à X Chen.
Materials
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker – orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical – sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
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