إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية للفأر في الخلايا الصباغية
Summary
هنا ، نصف نظام إعادة برمجة مباشر محسن للخلايا الصباغية ونظام تعبئة فيروسات عالي الكفاءة ومركز يضمن إعادة برمجة مباشرة سلسة.
Abstract
فقدان وظيفة الخلايا الصباغية يؤدي إلى البهاق ، مما يؤثر بشكل خطير على الصحة البدنية والعقلية للأفراد المصابين. في الوقت الحاضر ، لا يوجد علاج فعال طويل الأجل للبهاق. لذلك ، من الضروري تطوير علاج مناسب وفعال للبهاق. يبدو أن تقنية الطب التجديدي لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا صباغية هي علاج جديد واعد للبهاق. وهذا ينطوي على إعادة برمجة مباشرة من خلايا الجلد المريض إلى الخلايا الصباغية الوظيفية للمساعدة في تخفيف فقدان الخلايا الصباغية في المرضى الذين يعانون من البهاق. ومع ذلك ، يجب اختبار هذه الطريقة أولا على الفئران. على الرغم من أن إعادة البرمجة المباشرة تستخدم على نطاق واسع ، إلا أنه لا يوجد بروتوكول واضح لإعادة البرمجة المباشرة في الخلايا الصباغية. علاوة على ذلك ، فإن عدد عوامل النسخ المتاحة ساحق.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول نظام تغليف فيروس lentivirus المركز لإنتاج عوامل النسخ المختارة لإعادة برمجة خلايا الجلد إلى الخلايا الصباغية ، بما في ذلك Sox10 و Mitf و Pax3 و Sox2 و Sox9 و Snai2. أصيبت الخلايا الليفية الجنينية الفئران (MEFs) بفيروس lentivirus المركز لجميع عوامل النسخ هذه لإعادة البرمجة المباشرة ل MEFs إلى الخلايا الصباغية المستحثة (iMels) في المختبر. علاوة على ذلك ، تم فحص عوامل النسخ هذه ، وتم تحسين النظام لإعادة البرمجة المباشرة إلى الخلايا الصباغية. تم زيادة التعبير عن العلامات المميزة للميلانين في iMels على مستوى الجين أو البروتين بشكل كبير. تشير هذه النتائج إلى أن إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية يمكن أن تكون استراتيجية علاجية جديدة ناجحة للبهاق وتؤكد آلية تطور الخلايا الصباغية ، والتي ستوفر الأساس لمزيد من إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية في الجسم الحي.
Introduction
البهاق هو مرض جلدي يؤثر بشكل خطير على الصحة البدنية والعقلية للأفراد المصابين. لأسباب مختلفة ، بما في ذلك تشوهات التمثيل الغذائي ، والإجهاد التأكسدي ، وتوليد الوسطاء الالتهابيين ، وانفصال الخلايا ، واستجابة المناعة الذاتية ، يتم فقدان الخلايا الصباغية الوظيفية ، ويتم إيقاف إفراز الميلانين ، مما يؤدي إلى تطور البهاق 1,2. تحدث هذه الحالة على نطاق واسع وهي مشكلة خاصة على الوجه. العلاج الرئيسي هو الاستخدام النظامي للكورتيكوستيرويدات وأجهزة المناعة. يمكن استخدام العلاج الضوئي للأمراض الجهازية أو المحلية ، وهناك علاجات جراحية ، مثل زرع الجلد المثقب وزرع الخلايا الصباغية الذاتية3،4،5. ومع ذلك ، فإن المرضى الذين يستخدمون العلاج الدوائي والعلاج الضوئي عرضة للانتكاس ، وهذه العلاجات لها آثار علاجية سيئة على المدى الطويل. العلاج الجراحي مؤلم وفعال بشكل معتدل فقط 2,6. لذلك ، هناك حاجة إلى استراتيجية علاجية جديدة وفعالة للبهاق.
إن إعادة برمجة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) تعكس هذه الخلايا من حالتها الطرفية إلى حالة متعددة القدرات ، وهي عملية تتوسط فيها عوامل النسخ ، Oct4 و Sox2 و Klf4 و c-Myc7. ومع ذلك ، نظرا لإمكانية الإصابة بالأورام ووقت الإنتاج الطويل ، فقد قوبلت هذه التكنولوجيا بالشك عند تطبيقها على الإعدادات السريرية8. إعادة البرمجة المباشرة هي تقنية تجعل نوعا واحدا من الخلايا الطرفية يتحول إلى نوع آخر من الخلايا الطرفية9. يتم تحقيق هذه العملية من خلال عوامل النسخ المناسبة. وقد تمت بالفعل إعادة برمجة خلايا مختلفة مباشرة بنجاح، بما في ذلك الخلايا العضلية القلبية10 والخلايا العصبية 11 وخلايا الشعر القوقعية12. حتى أن بعض الباحثين أعادوا برمجة أنسجة الجلد مباشرة في الموقع ، والتي يمكن استخدامها لإصلاح الجروح13. تشمل مزايا إعادة البرمجة المباشرة تقليل أوقات الانتظار والتكاليف ، وانخفاض خطر الإصابة بالسرطان ، وتقليل المشاكل الأخلاقية ، وفهم أفضل للآلية الكامنة وراء تحديد مصير الخلية9.
على الرغم من أن طريقة إعادة البرمجة المباشرة تستخدم على نطاق واسع ، إلا أنه لا توجد حاليا طريقة محددة لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا صباغية ، خاصة بسبب عوامل النسخ العديدة التي يجب مراعاتها14,15. تم استخدام عوامل النسخ ، Mitf و Sox10 و Pax3 ، لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى الخلايا الصباغية14. في المقابل ، تم استخدام مزيج من MITF و PAX3 و SOX2 و SOX9 أيضا لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا ميلانية بشرية في دراسة أخرى15. في هذا البروتوكول ، على الرغم من استخدام طريقة فحص مختلفة ، تم الحصول على نفس النتيجة مع مزيج من Mitf و Sox10 و Pax3 لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا صباغية كما هو موضح سابقا14. يمكن أن يوفر تطوير نظام لتوليد الخلايا الصباغية من خلايا الجلد الأخرى مخططا لتحويل خلايا الجلد الأخرى لمرضى البهاق إلى خلايا صباغية. وبالتالي ، من الأهمية بمكان بناء طريقة بسيطة وفعالة لإعادة البرمجة المباشرة هذه لتوليد الخلايا الصباغية بنجاح.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد جودة الفيروس أمرا بالغ الأهمية لنجاح إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الصباغية في هذا البروتوكول. طريقة تعبئة وتركيز الفيروسات في هذا البروتوكول بسيطة وسهلة التكرار ولا تعتمد على أي كاشف مركز مساعد. يمكن اتباع هذا البروتوكول بنجاح في معظم المختبرات. لضمان جودة الفيروس المركز ، تحتاج ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82070638 و 81770621) ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20180281).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. Vitiligo. Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).
- Picardo, M., et al. Vitiligo. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. Surgical therapies for vitiligo. Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
