Summary
在这里，我们描述了一种针对黑素细胞的优化直接重编程系统和一种高效、浓缩的病毒包装系统，可确保顺利的直接重编程。
Abstract
黑素细胞功能的丧失导致白癜风，严重影响受影响个体的身心健康。目前，白癜风没有有效的长期治疗。因此，必须开发一种方便有效的白癜风治疗方法。将皮肤细胞直接重编程为黑素细胞的再生医学技术似乎是一种有前途的白癜风新疗法。这涉及将患者的皮肤细胞直接重编程为功能性黑素细胞，以帮助改善白癜风患者黑素细胞的丢失。然而，这种方法需要首先在小鼠身上进行测试。虽然直接重编程被广泛使用，但没有明确的方案可以直接重编程为黑素细胞。此外，可用转录因子的数量是压倒性的。
在这里，提出了一种浓缩的慢病毒包装系统方案，以产生用于将皮肤细胞重编程为黑素细胞的转录因子，包括Sox10，Mitf，Pax3，Sox2，Sox9和Snai2。小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）感染了所有这些转录因子的浓缩慢病毒，用于 在体外将MEF直接重编程为诱导黑素细胞（iMels）。此外，筛选了这些转录因子，并优化了系统以直接重编程为黑素细胞。iMels中黑色素特征标记物在基因或蛋白质水平上的表达显著增加。这些结果表明，将成纤维细胞直接重编程为黑素细胞可能是白癜风的成功新治疗策略，并证实了黑素细胞发育的机制，这将为成纤维细胞在 体内进一步直接重编程为黑素细胞提供基础。
Introduction
白癜风是一种皮肤病，严重影响受影响个体的身心健康。由于代谢异常，氧化应激，炎症介质的产生，细胞脱离和自身免疫反应等各种原因，功能性黑素细胞丢失，黑色素分泌停止，导致白癜风1，2的发展。这种情况发生得很广泛，在脸上尤其成问题。主要治疗方法是全身使用皮质类固醇和免疫调节剂。光疗可用于全身性或局部性疾病，并且有手术治疗，如穿孔皮肤移植和自体黑素细胞移植3，4，5。然而，使用药物治疗和光疗的患者容易复发，这些治疗的长期治疗效果较差。手术治疗是创伤性的，只有中等效果2，6。因此，白癜风需要一种新的有效治疗策略。
诱导多能干细胞（iPSCs）的重编程将这些细胞从其终末状态逆转为多能状态，这是由转录因子Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc7介导的过程。然而，由于致瘤的可能性和较长的生产时间，该技术在应用于临床环境8时遭到了怀疑。直接重编程是一种技术，它使一种类型的终端单元转换为另一种类型的终端单元9。该过程是通过合适的转录因子实现的。各种细胞已经直接成功重编程，包括心肌细胞10，神经元11和耳蜗毛细胞12。一些研究人员甚至直接 原位重新编程皮肤组织，可用于伤口修复13。直接重编程的优点包括减少等待时间和成本，降低癌症风险，减少伦理问题，以及更好地了解细胞命运决定的潜在机制9。
虽然直接重编程法被广泛使用，但目前还没有确定的方法可以将皮肤细胞直接重编程为黑素细胞，特别是因为需要考虑许多转录因子14，15。转录因子Mitf，Sox10和Pax3已被用于将皮肤细胞直接重编程为黑色素细胞14。相比之下，在另一项研究15中，MITF，PAX3，SOX2和SOX9的组合也被用于将皮肤细胞直接重编程为人类黑素细胞。在该协议中，尽管使用了不同的筛选方法，但使用Mitf，Sox10和Pax3的组合获得了相同的结果，用于将皮肤细胞直接重编程为黑色素细胞，如前所述14。开发一种从其他皮肤细胞产生黑素细胞的系统可以提供将白癜风患者的其他皮肤细胞转化为黑素细胞的方案。因此，构建一种简单有效的方法对于这种直接重编程以成功产生黑素细胞至关重要。
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Protocol
这项工作得到了江苏大学实验动物管理和使用委员会（UJS-IACUC-AP--20190305010）的批准。实验严格按照国际实验动物护理评估和认证协会（AAALAC International）制定的标准进行。没有涉及人类的实验，因此这项工作不需要人类研究伦理委员会的批准。有关试剂的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 构建转录因子浓缩慢病毒包装系统
- 浓缩病毒的产生（图1A，B）
- 将1.5×106个HEK-293T细胞放入60mm培养皿中，并在37°C下用5%CO2加湿培养箱中用正常培养基（参见表1）培养这些细胞。
注意：如果病毒需要分批包装，可以使用100mm细胞培养皿（有关详细信息，请参阅 表2）。 - 24小时后，确保HEK-293T细胞在转导当天达到80-90%汇合，并用3.5mL DMEM（每1 cm 2150μLDMEM）替换培养基。将细胞在37°C下置于加湿的培养箱中，用5%CO2培养2小时。
注意：替代培养基必须不含血清，以便细胞可以“饥饿”以获得更好的质粒转染。 - 制备含有3μgMitf，Sox10，Pax3，Sox2，Sox9或Snai2的目标质粒的质粒（混合物A）的混合物;1μg包装质粒PMD2。G，和2μg的包装质粒PSPAX2。用无血清DMEM组成混合物A至150μL的体积。通过加入12μL转染试剂（体积是所有质粒总质量的两倍）来制备转染试剂的混合物（混合物B），并用无血清DMEM将混合物B的体积组成为150μL。
注意：在准备混合物时，重要的是要缓慢添加液体以避免气泡。 - 混合混合物A并在室温下静置5分钟后混合B。将混合物在室温下孵育20-30分钟以形成转染复合物。
- 将HEK-293T细胞从培养箱中取出，用DMEM + 2%FBS替换培养基，滴加步骤1.1.4中的混合物，轻轻混合液体。
- 8小时后，用3.5mL正常培养基更换培养基。更换培养基后，每24小时和48小时收集一次病毒上清液。
- 混合在两个不同时间点收集的病毒上清液。在4°C下以200× g 离心5分钟。 将上清液通过0.45μm过滤器，并将其收集在50mL无菌锥形管中。
注意：在24小时收集的病毒可以储存在4°C下，并与在48小时收集的病毒混合。 - 通过在4°C下以6000× g 离心过夜（〜16小时）浓缩病毒上清液。确保离心后锥形管底部的病毒沉淀可见。
- 慢慢倒出上清液。将病毒沉淀溶解在正常培养基的体积中，该体积是病毒上清液体积的1/100 。使用P1000微量移液管，轻轻地上下移液，直到获得均匀的混合物。根据需要将浓缩的病毒分成微量离心管。储存在−80°C。
注意：使用此方法，病毒的浓度为 100 倍。浓缩病毒（100x）可以在-80°C下储存>1年。 避免病毒反复冷冻和解冻。
- 将1.5×106个HEK-293T细胞放入60mm培养皿中，并在37°C下用5%CO2加湿培养箱中用正常培养基（参见表1）培养这些细胞。
- 检测浓缩病毒滴度（图1C）
- 平板1×105 个HEK-293T细胞放入6孔板的一个孔中。记得添加一个井作为阴性对照。在37°C下用正常培养基在加湿的培养箱中用5%CO2培养这些细胞。
- 24小时后向每个孔中加入0.1μL或0.2μL荧光浓缩病毒（100x），并向每个孔中加入4ng / μL阳离子聚合物转染试剂。感染后约8-12小时，用普通培养基替换培养基。
注：为保证荧光检测的准确性和效率，感染率必须为10-30%。加入0.1 μL或0.2 μL荧光浓缩病毒可将感染效率维持在此范围内。浓缩病毒滴度至少可以达到 1 × 108 转导单位 （TU）/mL。 - 感染后约48小时，用1mL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤培养皿以除去死细胞。
- 在室温下，使用每孔250μL0.05%胰蛋白酶-EDTA在6孔板中胰蛋白酶消化这些细胞1分钟。在4°C下以200× g 离心5分钟，然后除去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中，将悬浮液加入5 mL聚苯乙烯圆底管中，并使用流式细胞术检测病毒荧光（绿色荧光蛋白，GFP +）的感染效率。
- 使用以下公式计算浓缩病毒滴度：105 （细胞体积）×感染率（GFP +%）/添加病毒体积（0.1μL或0.2μL）。
2.将成纤维细胞直接重编程为黑素细胞（图2A）
- 在室温下用1mL 0.1%明胶溶液涂覆一孔6孔细胞培养板15-30分钟。确保孔完全覆盖0.1%明胶溶液。包衣后吸出0.1%明胶溶液。
注意：准备0.1%明胶溶液（100 mL），如下所示：将0.1g明胶粉溶解在高压灭菌玻璃瓶中的100mL超纯水中，然后在4°C下储存不超过2个月。 - 板5×104 个MEF放入涂有0.1%明胶的6孔板的一个孔中（如步骤2.1所示），并在37°C下用正常培养基培养这些细胞在加湿的培养箱中用5%CO2 过夜。
- 24小时后，确认MEF已达到40-50%汇合。将培养基更换为普通培养基。
- 在第0天，从冰箱中取出浓缩的病毒，并在冰上融化病毒。使用等式 （1） 计算要添加的病毒的体积。根据计算的体积，将六种转录因子Mitf，Pax3，Sox10，Sox9，Sox2和Snai2（见 材料表）的浓缩病毒加入每个孔中，然后加入4μg/ mL的阳离子聚合物转染剂。
细胞数（5×104）×30（感染的多重性，MOI）/病毒滴度（1） - 在感染后的第1天，8-12小时，除去含有病毒的培养基并用新鲜的正常培养基替换，同时加入0.5μg/ mL嘌呤霉素以筛选稳定的感染细胞系。
- 在感染后第2天，48小时，用重编程培养基逐渐替换上清液培养基。首先，改变总培养基体积的1 /4，并加入3μM CHIR99021。
- 从第3天到第7天，根据细胞的状况，通过逐渐更换更高比例的重编程培养基（见 表1）来更换培养基，并在5天内切换到完全重编程培养基。
注意：在此期间，必须每天使用嘌呤霉素和CHIR99021。许多死细胞将在改变重编程培养基的第一天和第二天出现。这是正常的，因为细胞逐渐适应转化。因此，需要逐渐改变培养基，以确保细胞的健康增殖。 - 为了传代细胞，加入500μL0.05%胰蛋白酶- EDTA以在室温下消化细胞3分钟。当~60%的细胞漂浮起来时，通过添加2倍于消化酶体积的正常培养基来停止消化。将细胞悬浮液收集在15mL无菌锥形管中，在4°C下以200× g 离心5分钟，除去上清液，用重编程培养基重悬细胞沉淀，并将细胞以3×104 / cm2的密度置入60mm无菌培养皿中。在37°C下在加湿的5%CO2 培养箱中培养这些细胞。
注意：从第8天到第21天，这些细胞每3-5天进行一次亚培养，并在60毫米无菌培养皿中培养以扩增。它们可以被培养到至少达到第5段。
3. 优化直接重编程和识别
- 筛选优化的转录因子
- 重复步骤2.1-2.7，每次减少六种转录因子中的一种。用五种转录因子组合的病毒感染MEF。
- 感染后7天，提取这些细胞16的RNA，并使用逆转录PCR（RT-PCR）17 分析其黑素细胞基因的表达水平，通过逐个去除它们来筛选对转化为黑素细胞影响最大的转录因子（图3A）。
- 使用影响向黑素细胞转化以感染MEF的前三个转录因子。重复步骤 2.1-2.7。
注意：感染后七天，黑素细胞基因应该在这些转化的细胞中可检测到（图3B）。用于iMels表征的引物信息包含在 表3中。
- 鉴定诱导黑素细胞（iMels）
- 使用免疫荧光染色18 验证iMels表达黑素细胞蛋白，包括TYRP-1和DCT（图4A）。
- 黑色素特异性3，4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）染色（图4B）
- 制备4%多聚甲醛（10mL），如下所示：将0.4g多聚甲醛粉末溶解在10mL PBS中。将溶液置于56°C的烘箱中2小时以促进溶解。
注意：溶液可以在4°C下保存不超过一个月。 - 在30毫米的培养皿中培养iMels，并用预热的PBS清洗两次。加入1mL4%多聚甲醛固定细胞20分钟，并用PBS洗涤培养皿3次。
- 使用前将0.01克L-DOPA粉末溶解在10毫升PBS中，制备0.1%DOPA染色溶液（10毫升）。将溶液置于37°C的水浴中30分钟;摇晃几次以促进溶解。
- 加入1mL新鲜制备的0.1%DOPA染色溶液。在37°C的烘箱中孵育2-5小时。如果没有棕黑色颗粒，继续在37°C下孵育2小时，但不进行>5小时。每30分钟检查一次样品。
- 用PBS清洗盘子3次，每次1分钟。用1mL苏木精染色溶液染色细胞核2分钟。
- 对于长期储存，使用95%乙醇使样品脱水3分钟，然后使用100%乙醇脱水5分钟。用二甲苯和中性香脂密封盘子。
- 制备4%多聚甲醛（10mL），如下所示：将0.4g多聚甲醛粉末溶解在10mL PBS中。将溶液置于56°C的烘箱中2小时以促进溶解。
- 黑色素特异性马森-丰塔纳染色（图4B）
- 将iMels放入30mm培养皿中，并用4%多聚甲醛固定细胞20分钟;用PBS将盘子洗3次。
- 从Masson-Fontana染色试剂盒中加入1mL溶液A（氨银溶液）（参见 材料表），将培养皿置于暗箱中，并将暗箱置于56°C的烤箱中15-40分钟。
注意：如果在烘箱中15分钟后不可见棕黑色颗粒，请将样品放回56°C烘箱中继续孵育，但不要孵育>40分钟。可以在暗箱中加入一些水以防止干燥。 - 吸取溶液A并用蒸馏水洗涤培养皿5-6次，每次1-2分钟。
- 从Masson-Fontana染色试剂盒中加入1mL溶液B（低溶液），并将培养皿在室温下放置3-5分钟。
- 吸出溶液B，用自来水洗碗3次，每次1分钟。
- 从Masson-Fontana染色试剂盒中加入1mL溶液C（中性红色染料），并将培养皿在室温下放置3-5分钟。
- 吸取溶液C并用蒸馏水洗涤培养皿3次，每次1分钟。
- 加入1mL100%乙醇进行快速脱水，3分钟后吸出乙醇。
注意：用二甲苯和中性香脂密封后，染色的样品可以储存很长时间。
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Representative Results
本文包括浓缩慢病毒包装系统的方案，用于生产转录因子慢病毒，用于将成纤维细胞直接重编程为黑素细胞，以及用于筛选转录因子和直接从MEF重编程黑素细胞的方案。
通过观察GFP的荧光强度（图1A）或流式细胞术（图1B）在用未浓缩慢病毒（1x）和浓缩慢病毒（100x）感染HEK-293T细胞48小时后，评估浓缩慢病毒生产的成功。浓缩病毒的滴度为108 TU / mL或更高，相对较高（图1C）。
成纤维细胞直接重编程为黑素细胞是通过感染转录因子慢病毒和用优化的重编程培养基转化来实现的。从MEF生成iMels的方案如图 2A所示。细胞形态在直接重编程过程中逐渐改变。细胞突触变得细长，细胞核增大。然而，这些细胞在〜第20天（〜5次传代）后逐渐老化（图2B）。
从最初的六个转录因子（Mitf，Pax3，Sox10，Sox9，Sox2和Snai2）中一次去除一个转录因子，以确定对重编程影响最大的转录因子。去除Mitf，Pax3或Sox10导致黑素细胞基因 Tyr， Tyrp1 和 Mlana 的表达沉默（图3A），表明这三种转录因子对成纤维细胞转化为黑素细胞的影响最大。用三种转录因子直接重编程诱导的黑素细胞基因的表达高于所有六种转录因子（图3B）。
最后，确定了使用这种优化的直接重编程系统获得的iMels的特征。使用免疫荧光染色检测黑素细胞标志物（TYR，TYYP1）的表达（图4A）。黑色素特异性染色方法，包括DOPA和Masson-Fontana染色，也显示出积极的结果（图4B）。
（A）用未浓缩慢病毒（1x）和浓缩慢病毒（100x）感染HEK-293T细胞后GFP的荧光强度（B）通过流式细胞术检测到的未浓缩慢病毒（1x）和浓缩慢病毒（100x）感染率的比较。（C）浓缩慢病毒的滴度估计。比例尺 = 250 μm。缩写：GFP =绿色荧光蛋白;TU = 转导单位。请点击此处查看此图的大图。
图 2：从 MEF 生成 iMels。 （一）iMels生成示意图。（B）在第0天，第3天，第10天和第20+天的直接重编程中从MEFs转换为iMels期间细胞形态的变化。比例尺 = 100 μm。缩写：iMels =诱导的黑素细胞;MEFs = 小鼠胚胎成纤维细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图3：筛选优化的转录因子。 （A）用五种转录因子转导的细胞中Tyr，Tyrp1和Mlana mRNA水平的qRT-PCR（原始六种转录因子之一已被去除）。MEF + EV和MEF + 6F分别用作阴性对照和阳性对照。mRNA表达归一化为Gapdh表达。（B）用原始的6种转录因子和3种转录因子转导的细胞中Tyr，Tyrp1和Mlana mRNA的qRT-PCR水平。MEF、MEF + EV 和 MMC 分别用作空白、阴性对照和正向对照。mRNA水平归一化为Gapdh水平。所有值均为三个独立实验的平均± SD。引物序列示于表3中。缩写：qRT-PCR = 定量逆转录PCR;MEF =小鼠胚胎成纤维细胞;MEF + EV = 小鼠胚胎成纤维细胞 + 空载体;MMC = 小鼠黑素细胞;6F = 六种转录因子，包括Mitf，Pax3，Sox10，Sox9，Sox2和Snai2;3F：三种转录因子，包括 Mitf、Pax3 和 Sox10。请点击此处查看此图的大图。
图 4：iMels 的功能识别。 （A）iMels中黑素细胞标志物（TYR，TYYP1）的免疫染色。比例尺 = 50 μm。请参阅本研究中使用的抗体稀释的材料 表 。（B）马森-丰塔纳染色和DOPA染色。MEF和Melan-a细胞系分别用作阴性对照和阳性对照。比例尺 = 50 μm。缩写：iMels =诱导的黑素细胞;DOPA = 3，4-二羟基苯丙氨酸;MEF = 小鼠胚胎成纤维细胞。 请点击此处查看此图的大图。
| 组件 | 剂量（浓度、体积） | 最终浓度 | |
| 普通培养基 （100 mL） | 二甲双胍/高血糖 | 89 毫升 | |
| 热灭活FBS | 10 毫升 | ||
| 抗生素（笔/链球菌） | 10000 U/毫升，1 毫升 | 100 欧/毫升 | |
| 重编程培养基 （100 mL） | 转速-1640 | 88 毫升 | |
| 热灭活FBS | 10 毫升 | ||
| 重组人 SCF | 200 微克/毫升，50 微克 | 100纳克/毫升 | |
| 重组人bFGF | 4 微克/毫升，250 微升 | 10纳克/毫升 | |
| 重组人胰岛素 | 10 毫克/毫升，50 微升 | 5 微克/毫升 | |
| EDN3 人类 | 100 μM，100 μL | 0.1 微米 | |
| 霍乱毒素 | 0.3 毫克/毫升，0.56 微升 | 20 pM | |
| 佛波罗12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（TPA） | 1 毫微米，20 微克 | 200 海里 | |
| 氢化可的松 | 100 微克/毫升，500 微克 | 0.5微克/毫升 | |
| 腺嘌呤 | 40 毫克/毫升，60 微升 | 24微克/毫升 |
表1：正常和重新编程介质的组件。
| 文化菜 | 接种密度（细胞/培养皿） | 中等（毫升） | 质粒系统 | 转染试剂（μL） | ||
| 目标质粒（μg） | PMD2.G（微克） | PSPAX2 （μg） | ||||
| 35 毫米 | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 毫米 | 1.5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 毫米 | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
表2：慢病毒包装系统的详细信息。
| RT-PCR 引物 | |
| 目标 | 底漆套装 |
| 加普德 | 前锋： 中国农业科学院 |
| 反向： CATTCGGCCTTGACTGTG | |
| 泰尔 | 前锋： GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| 反向：ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| 泰瑞普1 | 前锋： AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| Reverse： TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT | |
| 姆拉纳 | 前进：AGACGCTCTCT |
| 反向： TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
表 3：引物信息。
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Discussion
病毒的质量对于该方案中直接重编程为黑素细胞的成功至关重要。该方案中病毒的包装和浓缩方法简单易重复，不依赖任何其他辅助浓缩试剂。在大多数实验室中可以成功遵循该方案。为保证浓缩病毒的质量，以下几点需要特别注意。一个是HEK-293T的电池状态。虽然HEK-293T细胞是永生化细胞，但用于制造浓缩病毒的细胞必须是10次传代内的健康细胞（滴度随着传代次数的增加而降低）。
另一个关键点是所用转染试剂（在本例中为脂质甘胺）的比例。由于添加转染试剂后细胞受损，因此必须反复检查试剂与质粒的比例，以确保细胞的最佳状态和病毒的质量。转染试剂与质粒的比例为2：1，最适合HEK-293T细胞在该系统中包装病毒。此外，所有步骤都需要在整个过程中进行轻柔的处理。由于病毒颗粒在包衣后会被吸收，从而影响病毒滴度，因此在包装病毒时不建议在培养皿中涂上任何基质。由于HEK-293T分离的可能性，必须仔细更换上清液，特别是当24小时后收集病毒上清液后加入新鲜培养基时。其他一些考虑因素包括细胞密度、转染时间的长短以及培养基中的血清含量。这些都是影响转染效率的重要问题。该方案中提出的条件是最合适的，基于经过多次重复实验后获得的结果。
在直接重编程到黑素细胞的过程中，重要的是要考虑原始细胞MEF的状态和用于直接重编程的MEF的密度。在开始直接重编程之前，必须在非包衣细胞培养皿中培养MEF。应选择增殖期（40-50%汇合）的细胞进行直接重编程;感染效率随着细胞密度的增加而降低。重新编程的细胞需要接种在明胶包被的培养皿中。
病毒感染细胞所需的时间长度也至关重要;感染时间过长会损害细胞存活，而感染时间太短会降低效率。在该协议中，发现8小时适合浓缩病毒感染MEF。最后一个关键点是改变重编程培养基的正确方法。MEF需要适应新的媒介。必须每天检查细胞的状态，并且必须根据细胞状态仔细更换培养基。太快地改变重编程培养基会导致大量细胞死亡。
在培养和传代培养iMels时，细胞的传代密度至关重要。iMels需要相对较高的密度来保持生长。细胞突触应该相互接触，以使这些细胞正常增殖。如果密度太低，细胞可能会停止增殖。在这里，3 ×104 / cm2 的密度被发现是iMels的合适通道密度。5次传代后，iMels开始老化（图2B）;此时黑色素更成熟，所得细胞可用于免疫荧光，DOPA或Masson-Fontana染色。细胞的早期传代可用于RT-PCR，因为基因的表达将在相对较早的阶段发生变化。
虽然直接重编程被广泛研究，但关于成纤维细胞直接重编程为黑素细胞的研究很少。不同的研究使用了不同的转录因子14，15，导致很多混淆。该协议解释了如何产生高质量的浓缩病毒并筛选几种转录因子以选择最重要的转录因子直接重编程到黑素细胞。在该方案中，培养基补充营养因子以直接重编程为黑色素细胞（表2）。最后，成功鉴定了功能性iMels。清晰优化的黑素细胞直接重编程系统可以为白癜风等脱色性疾病提供新的治疗策略。
但是，本文中介绍的技术仍然存在一些限制。首先，估计该协议的效率具有挑战性。CRISPR-Cas9基因编辑可以与该协议相结合，将黑素细胞基因（如 Tyr 或 Tyrp-1） 敲入初始细胞中，以观察重编程过程中诱导细胞的百分比。此外，该方案中使用的慢病毒引入系统可能携带基因重组和插入突变19的风险。将来，可以使用更有效，更安全的引入方法，例如非病毒重组蛋白表达载体或mRNA载体。该方案中的实验仍处于 体外 阶段。下一步是直接 在体内对黑素细胞进行重编程，使无色素的皮肤变得色素沉着，并使用直接重编程系统来设计有效的白癜风治疗方法。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
本研究部分由国家自然科学基金（82070638和81770621）和江苏省自然科学基金（BK20180281）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
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