Summary

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti di topo in melanociti

Published: August 27, 2021
doi:

Summary

Qui descriviamo un sistema di riprogrammazione diretta ottimizzato per i melanociti e un sistema di confezionamento dei virus concentrato ad alta efficienza che garantisce una riprogrammazione diretta senza intoppi.

Abstract

La perdita di funzione dei melanociti porta alla vitiligine, che influisce seriamente sulla salute fisica e mentale degli individui colpiti. Attualmente, non esiste un trattamento efficace a lungo termine per la vitiligine. Pertanto, è imperativo sviluppare un trattamento conveniente ed efficace per la vitiligine. La tecnologia di medicina rigenerativa per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti sembra essere un nuovo promettente trattamento della vitiligine. Ciò comporta la riprogrammazione diretta delle cellule cutanee del paziente in melanociti funzionali per aiutare a migliorare la perdita di melanociti nei pazienti con vitiligine. Tuttavia, questo metodo deve essere prima testato sui topi. Sebbene la riprogrammazione diretta sia ampiamente utilizzata, non esiste un protocollo chiaro per la riprogrammazione diretta in melanociti. Inoltre, il numero di fattori di trascrizione disponibili è schiacciante.

Qui, viene presentato un protocollo di sistema di confezionamento di lentivirus concentrato per produrre fattori di trascrizione selezionati per riprogrammare le cellule della pelle in melanociti, tra cui Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2. I fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono stati infettati dal lentivirus concentrato per tutti questi fattori di trascrizione per la riprogrammazione diretta dei MEF in melanociti indotti (iMels) in vitro. Inoltre, questi fattori di trascrizione sono stati sottoposti a screening e il sistema è stato ottimizzato per la riprogrammazione diretta ai melanociti. L’espressione dei marcatori caratteristici della melanina in iMels a livello genico o proteico è stata significativamente aumentata. Questi risultati suggeriscono che la riprogrammazione diretta dei fibroblasti in melanociti potrebbe essere una nuova strategia terapeutica di successo per la vitiligine e confermare il meccanismo di sviluppo dei melanociti, che fornirà la base per un’ulteriore riprogrammazione diretta dei fibroblasti in melanociti in vivo.

Introduction

La vitiligine è una malattia della pelle che colpisce seriamente la salute fisica e mentale degli individui colpiti. Per vari motivi, tra cui anomalie metaboliche, stress ossidativo, generazione di mediatori infiammatori, distacco cellulare e risposta autoimmune, i melanociti funzionali vengono persi e la secrezione di melanina viene interrotta, portando allo sviluppo della vitiligine 1,2. Questa condizione si verifica ampiamente ed è particolarmente problematica sul viso. Il trattamento principale è l’uso sistemico di corticosteroidi e immunomodulatori. La fototerapia può essere utilizzata per malattie sistemiche o locali e ci sono trattamenti chirurgici, come il trapianto di pelle perforata e il trapianto di melanociti autologhi 3,4,5. Tuttavia, i pazienti che usano la terapia farmacologica e la fototerapia sono inclini a ricadute e questi trattamenti hanno scarsi effetti terapeutici a lungo termine. Il trattamento chirurgico è traumatico e solo moderatamente efficace 2,6. Pertanto, è necessaria una nuova ed efficace strategia terapeutica per la vitiligine.

La riprogrammazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) inverte queste cellule dal loro stato terminale a uno stato pluripotente, un processo mediato dai fattori di trascrizione, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc7. Tuttavia, a causa della possibilità di tumorigenicità e del lungo tempo di produzione, questa tecnologia è stata accolta con scetticismo quando applicata a contesti clinici8. La riprogrammazione diretta è una tecnologia che fa sì che un tipo di cella terminale si trasformi in un altro tipo di cella terminale9. Questo processo è ottenuto da fattori di trascrizione adeguati. Varie cellule sono già state riprogrammate direttamente con successo, tra cui cardiomiociti10, neuroni11 e cellule ciliate cocleari12. Alcuni ricercatori hanno persino riprogrammato il tessuto cutaneo direttamente in situ, che può essere utilizzato per la riparazione delle ferite13. I vantaggi della riprogrammazione diretta includono tempi e costi di attesa ridotti, minor rischio di cancro, meno problemi etici e una migliore comprensione del meccanismo alla base della determinazione del destino cellulare9.

Sebbene il metodo della riprogrammazione diretta sia ampiamente utilizzato, attualmente non esiste un metodo definito per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti, soprattutto a causa dei numerosi fattori di trascrizione da considerare14,15. I fattori di trascrizione, Mitf, Sox10 e Pax3, sono stati utilizzati per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti14. Al contrario, la combinazione di MITF, PAX3, SOX2 e SOX9 è stata utilizzata anche per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti umani in un altro studio15. In questo protocollo, nonostante l’uso di un diverso metodo di screening, lo stesso risultato è stato ottenuto con la combinazione di Mitf, Sox10 e Pax3 per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti come descritto in precedenza14. Lo sviluppo di un sistema per generare melanociti da altre cellule della pelle può fornire uno schema per trasformare altre cellule della pelle dei pazienti con vitiligine in melanociti. Quindi, è fondamentale costruire un metodo semplice ed efficiente per questa riprogrammazione diretta per generare melanociti con successo.

Protocol

Questo lavoro è stato approvato dal Comitato per la gestione e l’uso degli animali da laboratorio presso l’Università di Jiangsu (UJS-IACUC-AP–20190305010). Gli esperimenti sono stati eseguiti in stretta conformità con gli standard stabiliti dall’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Non c’erano esperimenti che coinvolgevano esseri umani, quindi questo lavoro non aveva bisogno dell’approvazione del comitato etico della ricerca umana. Fare riferime…

Representative Results

Questo articolo include i protocolli di un sistema di confezionamento concentrato di lentivirus per produrre lentivirus di fattori di trascrizione per la riprogrammazione diretta di fibroblasti a melanociti e protocolli per lo screening per i fattori di trascrizione e la riprogrammazione diretta dei melanociti dai MEF. Il successo della produzione concentrata di lentivirus è stato valutato osservando l’intensità di fluorescenza della GFP (Figura 1A) o mediante c…

Discussion

La qualità del virus è cruciale per il successo della riprogrammazione diretta ai melanociti in questo protocollo. Il metodo di confezionamento e concentrazione dei virus in questo protocollo è semplice e facile da ripetere e non si basa su nessun altro reagente concentrato ausiliario. Questo protocollo può essere seguito con successo nella maggior parte dei laboratori. Per garantire la qualità del virus concentrato, i seguenti punti richiedono un’attenzione speciale. Uno è lo stato della cella di HEK-293T. Sebbene…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato parzialmente supportato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) e della Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281).

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-062 Stored at -20 °C
0.45 μM filter Millipore SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube Falcon 352052
95%/100% ethanol LANBAO 210106 Stored at RT
Adenine Sigma A2786 Stock concentration 40 mg/mL
Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a Invitrogen A21137 Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep) Gibco 15140-122 Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody Millipore MABC592 Host/Isotype: Mouse IgG2a
Species reactivity: Mouse/Human
Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody Abcam ab74073 Host/Isotype: Rabbit IgG
Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Stock concentration 10 mM
Final concentration 3 μM
Cholera toxin Sigma C8052 Stock concentration 0.3 mg/mL
Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 111-165-144 Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose) HyClone SH30243.01 Stored at 4 °C
DMSO  Sigma D2650 Stored at RT
FBS Gibco 10270-106 Stored at -20 °C
Heat-inactivated before use
Gelatin Sigma G9391 Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) Hanheng Biological Technology Co., Ltd. pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 Stored at -20 °C
Hematoxylin Abcam ab220365 Stored at RT
Human EDN3 American-Peptide 88-5-10A Stock concentration 100 μM
Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone Sigma H0888 Stock concentration 100 µg/mL
Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA Sigma D9628 Stored at RT
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit Solarbio G2032 Stored at 4 °C
Neutral balsam Solarbio G8590 Stored at 4 °C
Paraformaldehyde Sigma P6148 Stored at RT
PBS (-) Gibco C10010500BT Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) Sigma P8139 Stock concentration 1 mM
Final concentration 200 nM
Polybrene Sigma H9268 cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL
Final concentration 4 ng/µL
Puromycin Gibco A11138-03 Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF Invitrogen 13256-029 Stock concentration 4 μg/mL
Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin Sigma  I3536 Stock concentration 10 mg/mL
Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF R&D 255-SC-010 Stock concentration 200 μg/mL
Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640 Gibco 11875-093 Stored at 4 °C
Xylene Sigma 1330-20-7 Stored at RT

References

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Cite This Article
Zhang, Y., Liu, L., Jin, M., Sun, H., Zhang, H., Li, Y. Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes. J. Vis. Exp. (174), e62911, doi:10.3791/62911 (2021).

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