マウス線維芽細胞のメラノサイトへの直接リプログラミング
Summary
ここでは、メラノサイト用に最適化されたダイレクトリプログラミングシステムと、スムーズなダイレクトリプログラミングを保証する高効率で濃縮されたウイルスパッケージングシステムについて説明します。
Abstract
メラノサイトの機能の喪失は白斑につながり、罹患した個体の身体的および精神的健康に深刻な影響を及ぼす。現在、白斑の効果的な長期治療はありません。したがって、白斑の便利で効果的な治療法を開発することが不可欠です。皮膚細胞をメラノサイトに直接リプログラミングする再生医療技術は、白斑の有望な新規治療法であると思われる。これは、白斑患者のメラノサイトの損失を改善するのを助けるために、患者の皮膚細胞を機能的なメラノサイトに直接リプログラミングすることを含む。しかしながら、この方法は、最初にマウス上で試験される必要がある。直接リプログラミングは広く使用されているが、メラノサイトへの直接リプログラミングのための明確なプロトコルはない。さらに、利用可能な転写因子の数は圧倒的である。
ここでは、皮膚細胞をメラノサイトにリプログラミングするために選択された転写因子(Sox10、Mitf、Pax3、Sox2、Sox9、およびSnai2を含む)を産生するための濃縮レンチウイルスパッケージングシステムプロトコルが提示される。マウス胚性線維芽細胞(MEF)を、 インビトロで誘導メラノサイト(iMels)へのMEFの直接リプログラミングのために、これらすべての転写因子について濃縮レンチウイルスに感染させた。さらに、これらの転写因子をスクリーニングし、メラノサイトへの直接リプログラミングのために系を最適化した。iMelsにおけるメラニンの特徴マーカーの発現は、遺伝子またはタンパク質レベルで有意に増加した。これらの結果は、線維芽細胞からメラノサイトへの直接リプログラミングが白斑の新たな治療戦略として成功し、メラノサイト発生のメカニズムを確認し、線維芽細胞からメラノサイトへのさらなる直接リプログラミングの基礎を 生体内で提供できることを示唆する。
Introduction
白斑は、罹患した個体の身体的および精神的健康に深刻な影響を与える皮膚疾患である。代謝異常、酸化ストレス、炎症メディエーターの生成、細胞剥離、自己免疫応答など様々な理由により、機能的なメラノサイトが失われ、メラニンの分泌が停止し、白斑1,2の発症につながる。この状態は広く発生し、顔に特に問題があります。主な治療法は、コルチコステロイドおよび免疫調節剤の全身使用である。光線療法は全身性または局所疾患に使用でき、穿孔皮膚移植および自家メラノサイト移植などの外科的治療がある3,4,5。しかし、薬物療法や光線療法を使用する患者は再発しやすく、これらの治療法は長期的な治療効果が低い。外科的治療は外傷性であり、適度にしか有効ではない2,6。したがって、白斑には新しく効果的な治療戦略が必要です。
人工多能性幹細胞(iPSC)のリプログラミングは、転写因子Oct4、Sox2、Klf4、およびc-Myc7によって媒介されるプロセスである、これらの細胞を末端状態から多能性状態に逆転させる。しかし、造腫瘍性の可能性と長い生産時間のために、この技術を臨床現場に適用すると懐疑的な見方をされている8。ダイレクトリプログラミングは、あるタイプの端末セルを別のタイプのターミナルセル9に変換する技術である。このプロセスは、適切な転写因子によって達成される。心筋細胞10、ニューロン11、および蝸牛有毛細胞12を含む様々な細胞が、既に首尾に直接再プログラムされている。一部の研究者は、皮膚組織をその場で直接再プログラムし、創傷修復に使用することができる13。直接リプログラミングの利点には、待ち時間とコストの削減、がんのリスクの低下、倫理的問題の減少、および細胞運命決定の根底にあるメカニズムのより良い理解が含まれます9。
直接リプログラミング法は広く使用されているが、特に考慮されるべき多数の転写因子のために、皮膚細胞をメラノサイトに直接リプログラミングするための明確な方法は現在のところ存在しない14,15。転写因子であるMitf、Sox10、およびPax3は、皮膚細胞をメラノサイト14に直接リプログラミングするために使用されている。対照的に、MITFおよびPAX3、SOX2、およびSOX9の組み合わせは、別の研究15において、皮膚細胞のヒトメラノサイトへの直接リプログラミングにも使用されている。このプロトコールでは、異なるスクリーニング方法を使用しているにもかかわらず、先に説明したように皮膚細胞をメラノサイトに直接リプログラミングするためのMitf、Sox10、およびPax3の組み合わせでも同じ結果が得られた14。他の皮膚細胞からメラノサイトを生成するシステムを開発することは、白斑患者の他の皮膚細胞をメラノサイトに変換するためのスキームを提供することができる。したがって、メラノサイトを正常に生成するためには、この直接リプログラミングのための簡単で効率的な方法を構築することが重要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ウイルスの品質は、このプロトコルにおけるメラノサイトへの直接リプログラミングの成功に不可欠です。このプロトコルでウイルスをパッケージングして濃縮する方法は、簡単で繰り返しが容易であり、他の補助濃縮試薬に依存しない。このプロトコルは、ほとんどの研究室でうまく従うことができます。濃縮ウイルスの品質を確保するためには、以下の点に特に注意が必要です。一つはH…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(82070638および81770621)および江蘇省自然科学財団(BK20180281)からの助成金によって部分的に支援された。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
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