Directe herprogrammering van muisfibroblasten in melanocyten
Summary
Hier beschrijven we een geoptimaliseerd direct herprogrammeringssysteem voor melanocyten en een zeer efficiënt, geconcentreerd virusverpakkingssysteem dat zorgt voor een soepele directe herprogrammering.
Abstract
Het verlies van functie van melanocyten leidt tot vitiligo, dat de fysieke en mentale gezondheid van de getroffen personen ernstig beïnvloedt. Momenteel is er geen effectieve langetermijnbehandeling voor vitiligo. Daarom is het noodzakelijk om een handige en effectieve behandeling voor vitiligo te ontwikkelen. Regeneratieve geneeskunde technologie voor directe herprogrammering van huidcellen in melanocyten lijkt een veelbelovende nieuwe behandeling van vitiligo. Dit omvat de directe herprogrammering van de huidcellen van de patiënt in functionele melanocyten om het verlies van melanocyten bij patiënten met vitiligo te helpen verbeteren. Deze methode moet echter eerst op muizen worden getest. Hoewel directe herprogrammering veel wordt gebruikt, is er geen duidelijk protocol voor directe herprogrammering in melanocyten. Bovendien is het aantal beschikbare transcriptiefactoren overweldigend.
Hier wordt een geconcentreerd lentivirus-verpakkingssysteemprotocol gepresenteerd om transcriptiefactoren te produceren die zijn geselecteerd voor het herprogrammeren van huidcellen naar melanocyten, waaronder Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 en Snai2. Muis embryonale fibroblasten (MEF’s) werden geïnfecteerd met het geconcentreerde lentivirus voor al deze transcriptiefactoren voor de directe herprogrammering van de MEF’s in geïnduceerde melanocyten (iMels) in vitro. Bovendien werden deze transcriptiefactoren gescreend en werd het systeem geoptimaliseerd voor directe herprogrammering naar melanocyten. De expressie van de karakteristieke markers van melanine in iMels op gen- of eiwitniveau was significant verhoogd. Deze resultaten suggereren dat directe herprogrammering van fibroblasten naar melanocyten een succesvolle nieuwe therapeutische strategie voor vitiligo zou kunnen zijn en het mechanisme van melanocytenontwikkeling zou kunnen bevestigen, wat de basis zal vormen voor verdere directe herprogrammering van fibroblasten in melanocyten in vivo.
Introduction
Vitiligo is een huidziekte die de fysieke en mentale gezondheid van de getroffen personen ernstig beïnvloedt. Om verschillende redenen, waaronder metabole afwijkingen, oxidatieve stress, generatie van ontstekingsmediatoren, celloslating en auto-immuunrespons, gaan de functionele melanocyten verloren en wordt de afscheiding van melanine gestopt, wat leidt tot de ontwikkeling van vitiligo 1,2. Deze aandoening komt veel voor en is bijzonder problematisch op het gezicht. De belangrijkste behandeling is het systemisch gebruik van corticosteroïden en immunomodulatoren. Fototherapie kan worden gebruikt voor systemische of lokale ziekten en er zijn chirurgische behandelingen, zoals geperforeerde huidtransplantatie en autologe melanocytentransplantatie 3,4,5. Patiënten die medicamenteuze therapie en fototherapie gebruiken, zijn echter vatbaar voor terugval en deze behandelingen hebben slechte therapeutische effecten op de lange termijn. Chirurgische behandeling is traumatisch en slechts matig effectief 2,6. Daarom is een nieuwe en effectieve therapeutische strategie nodig voor vitiligo.
De herprogrammering van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) keert deze cellen om van hun terminale toestand naar een pluripotente toestand, een proces gemedieerd door de transcriptiefactoren Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc7. Vanwege de mogelijkheid van tumorigeniciteit en de lange productietijd is deze technologie echter met scepsis ontvangen wanneer deze wordt toegepast op klinische omgevingen8. Directe herprogrammering is een technologie die het ene type terminalcel laat transformeren in een ander type terminalcel9. Dit proces wordt bereikt door geschikte transcriptiefactoren. Verschillende cellen zijn al direct met succes geherprogrammeerd, waaronder cardiomyocyten10, neuronen11 en cochleaire haarcellen12. Sommige onderzoekers hebben zelfs huidweefsel direct in situ geherprogrammeerd, dat kan worden gebruikt voor wondherstel13. De voordelen van directe herprogrammering zijn onder meer kortere wachttijden en kosten, een lager risico op kanker, minder ethische problemen en een beter begrip van het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de bepaling van het lot van cellen9.
Hoewel de directe herprogrammeringsmethode veel wordt gebruikt, is er momenteel geen definitieve methode voor de directe herprogrammering van huidcellen tot melanocyten, vooral vanwege de vele transcriptiefactoren die als14,15 moeten worden beschouwd. De transcriptiefactoren, Mitf, Sox10 en Pax3, zijn gebruikt voor directe herprogrammering van huidcellen in melanocyten14. Daarentegen is de combinatie van MITF, PAX3, SOX2 en SOX9 ook gebruikt voor directe herprogrammering van huidcellen in menselijke melanocyten in een andere studie15. In dit protocol werd, ondanks het gebruik van een andere screeningsmethode, hetzelfde resultaat verkregen met de combinatie van Mitf, Sox10 en Pax3 voor directe herprogrammering van huidcellen in melanocyten zoals eerder beschreven14. Het ontwikkelen van een systeem om melanocyten te genereren uit andere huidcellen kan een schema bieden voor het transformeren van andere huidcellen van vitiligopatiënten in melanocyten. Daarom is het cruciaal om een eenvoudige en efficiënte methode te construeren voor deze directe herprogrammering om melanocyten met succes te genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kwaliteit van het virus is cruciaal voor het succes van directe herprogrammering naar melanocyten in dit protocol. De methode voor het verpakken en concentreren van virussen in dit protocol is eenvoudig en gemakkelijk te herhalen en is niet afhankelijk van een ander hulpgeconcentreerd reagens. Dit protocol kan in de meeste laboratoria met succes worden gevolgd. Om de kwaliteit van het geconcentreerde virus te waarborgen, hebben de volgende punten speciale aandacht nodig. Een daarvan is de celstatus van HEK-293T. Hoewe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) en de Natural Science Foundation van de provincie Jiangsu (BK20180281).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. Vitiligo. Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).
- Picardo, M., et al. Vitiligo. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. Surgical therapies for vitiligo. Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
