Utveckling av en cellkokulturmodell för att efterlikna hjärt ischemi / reperfusion in vitro

Summary

Rumsligt avstånd är en nyckelparameter för att bedöma hypoxi / reoxygeneringsskada i en samodlingsmodell av separata endotel- och kardiomyocytcellskikt, vilket för första gången tyder på att optimering av samodlingsmiljön är nödvändig för att tillhandahålla en gynnsam in vitro-modell för att testa endotelcellernas roll i kardiomyocytskydd.

Abstract

Ischemisk hjärtsjukdom är den främsta orsaken till dödsfall och funktionshinder över hela världen. Reperfusion orsakar ytterligare skada utöver ischemi. Endotelceller (ECs) kan skydda kardiomyocyter (CM) från reperfusionsskada genom cell-cellinteraktioner. Samkulturer kan hjälpa till att undersöka rollen som cell-cellinteraktioner. En blandad samodling är det enklaste tillvägagångssättet men är begränsat eftersom isolerade behandlingar och nedströms analyser av enskilda celltyper inte är möjliga. För att undersöka om ECs kan dosberoende dämpa CM-cellskador och om detta skydd kan optimeras ytterligare genom att variera kontaktavståndet mellan de två cellinjerna, använde vi Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells och Adult Mouse Cardiomyocytes för att testa tre typer av cellodlingsinsatser som varierade i deras intercellskiktavstånd vid 0,5, 1,0 respektive 2,0 mm. Endast i CM ökade cellskada enligt bedömning av laktatdehydrogenasfrisättning (LDH) signifikant under hypoxi och vidare vid reoxygenering när avståndet var 2,0 mm jämfört med 0,5 och 1,0 mm. När EG och CM var i nästan direktkontakt (0,5 mm) fanns det bara en mild dämpning av reoxygeneringsskadan hos CM efter hypoxi. Denna dämpning ökade signifikant när det rumsliga avståndet var 1,0 mm. Med 2,0 mm avstånd dämpade ECs CM-skada under både hypoxi och hypoxi / reoxygenering, vilket indikerar att tillräcklig kulturdistans är nödvändig för att ECs ska kunna överhörna med CM, så att utsöndrade signalmolekyler kan cirkulera och fullt stimulera skyddsvägar. Våra resultat tyder för första gången på att optimering av EC / CM-samkulturens rumsliga miljö är nödvändig för att tillhandahålla en gynnsam in vitro-modell för att testa EC: s roll i CM-skydd mot simulerad ischemi / reperfusionsskada. Målet med denna rapport är att tillhandahålla en steg-för-steg-strategi för utredare att använda denna viktiga modell till sin fördel.

Introduction

Ischemisk hjärtsjukdom är den främsta orsaken till dödsfall och funktionshinder över hela världen ^1,2. Behandlingsprocessen för reperfusion kan emellertid i sig orsaka kardiomyocytdöd, känd som myokardiell ischemi / reperfusion (IR) skada, för vilken det fortfarande inte finns något effektivt botemedel³. Endotelceller (EK) har föreslagits skydda kardiomyocyter (CM) genom utsöndring av parakrin signaler, liksom cell-till-cell-interaktioner⁴.

Cellodlingsmodeller har använts i stor utsträckning för att undersöka rollen av autokrina och / eller parakrina cell-cellinteraktioner på cellfunktion och differentiering. Bland samodlingsmodeller är blandad samodling den enklaste, där två olika typer av celler är i direktkontakt inom ett enda odlingsfack vid ett önskat cellförhållande⁵. Separata behandlingar mellan celltyper och nedströmsanalys av en enda celltyp är dock inte lätt genomförbara med tanke på den blandade populationen.

Tidigare studier visade att hypoxiska och ischemiska förolämpningar orsakar signifikant skada på cellmembranets integritet mätt genom frisättning av laktatdehydrogenas (LDH). Denna skada förvärras vid reoxygenering, som efterliknar reperfusionsskada ^6,7,8. Målet med det nuvarande protokollet var att testa hypoteserna att närvaron av ECs kan dosberoende dämpa cellmembranläckage av CM orsakad av hypoxi och reoxygenering (HR) och att den skyddande effekten av ECs kan optimeras genom att variera kontaktavståndet mellan de två cellinjerna. Således använde vi tre typer av cellodlingsinsatser och mus primära kranskärlsendotelceller och vuxna muskardiomyocyter. Insatserna, märkta av Corning, Merck Millipore och Greiner Bio-One gjorde det möjligt för oss att skapa tre olika cellodlingsöverhörningsförhållanden med intercellinjeavstånd på 0,5, 1,0 respektive 2,0 mm. 100 000 EP:er pläterades per insats i varje enskilt fall.

För att avgöra om densiteten hos EC i samodling bidrar till HR-skadedämpning i denna modell studerade vi dessutom dos-responsförhållandet mellan EG-koncentration och LDH-frisättning av CM. EC-ämnen pläterades till 25 000, 50 000 respektive 100 000 per insats i 2,0 mm-insatsen.

Denna rapport ger en steg-för-steg-strategi för utredare att använda denna viktiga modell till sin fördel.

Protocol

1. Experimentell beredning/plätering Underhåll CM och EM enligt tillverkarens instruktioner. Tina båda cellinjerna när de kommer från leverantörer. Platta i T25-kolvar efter att ha tvättats med färska medier. Det rekommenderas att köpa varje cellodlingsmedia från samma leverantörer som cellerna köptes från. Nästa dag, uppdatera cellerna med media och använd när de är sammanflytande. Håll cellodlingsinkubatorn vid 37 °C med 21 %O2, 5 %CO2</su…

Representative Results

Alla tre typer av insatser (A, B, C) som används i detta experiment har samma porstorlek på 0,4 μm. Den enda skillnaden mellan dem är insats-till-bashöjden, vilket gör att avstånden mellan de två samodlingade cellskikten kan vara 0,5, 1,0 respektive 2,0 mm (figur 3) och att de kommer från olika leverantörer (för detaljer se Materialtabell). För att etablera en in vitro-samodlingsmodell med separata lager av två cellinjer som …

Discussion

Kritiska steg i protokollet
Cellkokulturmodeller har använts för att studera cellulära mekanismer för hjärtskydd. Hur man skapar två separata lager med ett meningsfullt avstånd mellan dem är därför avgörande för utvecklingen av en lämplig samkulturmodell. En utmaning med att studera simulerad IR, dvs HR, skada är att inte bara ischemi (hypoxi) i sig utan också reperfusion (reoxygenering) förvärrar cellulär dysfunktion. Därför måste en realistisk modell återspegla dessa egenskaper…

Materials

Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested