Isolation og kultur af primære menneskelige gingivale epitelceller ved hjælp af Y-27632
Summary
Her præsenterer vi en modificeret metode til isolering og kultur af menneskelige gingivale epitelceller ved at tilføje Rock-hæmmeren, Y-27632, til den traditionelle metode. Denne metode er lettere, mindre tidskrævende, forbedrer stamcelleegenskaberne og producerer et større antal højpotentialede epitelceller både til laboratoriet og til kliniske anvendelser.
Abstract
Den gingival væv er den første struktur, der beskytter paradentose væv og spiller meningsfulde roller i mange mundtlige funktioner. Gingival epitel er en vigtig struktur af gingivalt væv, især i reparation og regenerering af paradentosevæv. Undersøgelse af gingival epitelcellers funktioner har afgørende videnskabelig værdi, såsom reparation af orale defekter og detektering af biomaterialers kompatibilitet. Som menneskelige gingival epitelceller er meget differentierede keratiniserede celler, deres levetid er kort, og de er vanskelige at passere. Indtil videre er der kun to måder at isolere og kultur gingival epitelceller, en direkte explant metode og en enzymatisk metode. Men den tid, der kræves for at opnå epitelceller ved hjælp af den direkte explant metode er længere, og cellen overlevelsesraten for den enzymatiske metode er lavere. Klinisk er erhvervelsen af gingivalt væv begrænset, så der er behov for et stabilt, effektivt og simpelt in vitro-isolations- og kultursystem. Vi forbedrede den traditionelle enzymatiske metode ved at tilføje Y-27632, en Rho-associeret kinase (ROCK) hæmmer, som selektivt kan fremme væksten af epitelceller. Vores modificerede enzymatiske metode forenkler trinene i den traditionelle enzymatiske metode og øger effektiviteten af dyrkning af epitelceller, hvilket har betydelige fordele i forhold til den direkte explant-metode og den enzymatiske metode.
Introduction
Den menneskelige gingiva, den første linje forsvarsstruktur, der beskytter paradentvæv, er ikke kun en fysisk og kemisk barriere1, men udskiller også forskellige klasser af inflammatoriske mæglere, der deltager i immunrespons og udgør en immunbarriere2,3. Den gingival epitel spiller en vigtig rolle i reparation og regenerering af paradentose væv. Derfor er det af stor betydning at studere gingival epitels forsvar og immunitet for at forstå forekomsten, diagnosen og behandlingen af parodontitis. Isolationen og kulturen af gingivale epitelceller fra human gingivalt væv er det første skridt, der kræves for at studere gingival epitel. En sådan procedure kræver grundlæggende operationer såsom fremstilling af frøceller til vævsteknik, in vitro-modeller af paradentose tilknyttede sygdomme og materialer til reparation af paradentosedefekter.
Primære gingival epitelceller er karakteriseret ved en lav division sats in vitro4, forskere har været på udkig efter en optimal isolation og dyrkning metode i årtier. Til dato er to forskellige teknikker, en direkte explant metode og en enzymatisk metode, almindeligt anvendt i laboratorier til at opnå primære gingival epitelceller in vitro4,5. Den direkte explant metode har fordele såsom kravet om en lavere mængde vævsprøver og simpel isolationsprocedure, men det har ulemperne ved længere kulturtid og modtagelighed for forurening5. Selvom den enzymatiske metode forkorter den nødvendige kulturtid, er effektiviteten relativt lav og varierer afhængigt af de anvendte enzymer og medium. Kedjarune et al.6 viste, at den direkte explant metode, som kræver mere tid før subkultur (2 uger), syntes at være mere vellykket for dyrkning gingival epitelceller i forhold til den enzymatiske metode. Men ved at sammenligne disse to metoder fandt Klingbeil et al.7, at den enzymatiske metode havde de bedste resultater for primære kulturer af orale epitelceller, og det var muligt at opnå det optimale celleudbytte inden for den korteste periode (11,9 dage mod 14,2 dage).
Derfor var det vigtigt at udvikle en mere bekvem og effektiv metode til isolering og kultur af orale epitelceller4. Vi har tidligere rapporteret, at tilføje Y-27632, en hæmmer af Rho-associeret protein kinase (ROCK), forenkler isolationsproceduren for menneskelige primære epidermale celler og keratinocytter fra voksne hudvæv8,9,10. Vi udviklede G-medium, et nyt betinget podningsmedium, der spontant adskiller epidermale fra dermale celler og understøtter væksten og udbyttet af primære epidermale celler8,9,10. I dette studie udviklede vi en ny serumfri isolations- og kulturteknik til gingivale epitelceller ved at kombinere G-medium med Y-27632. I det væsentlige er vores metode baseret på en forenkling af den traditionelle totrins enzymatiske metode, så vi sammenlignede vores nye metode med den direkte explant-metode. Denne modificerede enzymatiske metode forkorter betydeligt den tid, der kræves for at adskille gingivale epitelceller fra gingivalt væv og øger effektiviteten af dyrkning af gingivale epitelceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den gingival væv er en central struktur, der opretholder paradentose integritet og sundhed. Gingival epitelceller har betydelige roller i reparation og regenerering af paradentosevæv og kan anvendes i videnskabelig forskning og kliniske anvendelser og relaterede områder, herunder oral biologi, farmakologi, toksikologi, og mundslimhinden mangler18. Derfor er det nødvendigt at udvikle en stabil og effektiv metode til at høste orale epitelceller19. Primære epitelceller e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) og Key Research and Development Program i Shandong-provinsen (2019GSF108107) til X.W.; det centrale forsknings- og udviklingsprogram i Shandong-provinsen (2018GSF118240) til J.G.; Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2018WS163) til Z.X., og Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2019WS045) til J.S.
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T., Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. . The keratinocyte handbook. 375, 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
