Y-27632 का उपयोग करके प्राथमिक मानव गिंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं का अलगाव और संस्कृति
Summary
यहां हम पारंपरिक विधि में रॉक अवरोधक वाई-27632 जोड़कर मानव ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक संशोधित विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि आसान है, कम समय लेने वाली, स्टेम सेल गुणों को बढ़ाती है, और प्रयोगशाला और नैदानिक अनुप्रयोगों दोनों के लिए उच्च क्षमता वाले एपिथेलियल कोशिकाओं की बड़ी संख्या पैदा करती है।
Abstract
ग्इंगिवल ऊतक पहली संरचना है जो पीरियोडोन्टल ऊतकों की रक्षा करती है और कई मौखिक कार्यों में सार्थक भूमिका निभाती है। ग्इंगिवल एपिथेलियम विशेष रूप से पीरियोडोन्टल ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन में, ग्इंगिवल ऊतक की एक महत्वपूर्ण संरचना है। gingival epithelial कोशिकाओं के कार्यों का अध्ययन महत्वपूर्ण वैज्ञानिक मूल्य है, जैसे मौखिक दोषों की मरंमत और जैव सामग्री की अनुकूलता का पता लगाने के रूप में । चूंकि मानव गिंगिवल एपिथेलियल कोशिकाएं अत्यधिक विभेदित केराटिनाइज्ड कोशिकाएं हैं, इसलिए उनकी उम्र कम है, और उन्हें पारित करना मुश्किल है। अब तक, अलग-थलग करने और संस्कृति के केवल दो तरीके हैं, एक प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि और एक एंजाइमेटिक विधि। हालांकि, प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि का उपयोग करके एपिथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय लंबा है, और एंजाइमेटिक विधि की सेल जीवित रहने की दर कम है। चिकित्सकीय रूप से, जिजिवल ऊतक का अधिग्रहण सीमित है, इसलिए एक स्थिर, कुशल और सरल इन विट्रो अलगाव और संस्कृति प्रणाली की आवश्यकता है। हमने वाई-27632, एक Rho-संबद्ध किनेज़ (रॉक) अवरोधक जोड़कर पारंपरिक एंजाइमेटिक विधि में सुधार किया, जो चुनिंदा रूप से एपिथेलियल कोशिकाओं के विकास को बढ़ावा दे सकता है। हमारी संशोधित एंजाइमेटिक विधि पारंपरिक एंजाइमेटिक विधि के चरणों को सरल बनाती है और एपिथेलियल कोशिकाओं को बनाने की दक्षता को बढ़ाती है, जिसके प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि और एंजाइमेटिक विधि पर महत्वपूर्ण लाभ होते हैं।
Introduction
मानव gingiva, पहली पंक्ति रक्षा संरचना है कि पीरियोडोन्टल ऊतक की रक्षा करता है, न केवल एक भौतिक और रासायनिक बाधा1है, लेकिन यह भी भड़काऊ मध्यस्थों के विभिन्न वर्गों का रहस्य है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में भाग लेने और एक प्रतिरक्षा बाधा2,3 कागठन। जिंगल एपिथेलियम पीरियोडोन्टल ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसलिए, पीरियोडोन्टाइटिस की घटना, निदान और उपचार को समझने के लिए ग्इंगिवल एपिथेलियम की रक्षा और प्रतिरक्षा का अध्ययन करना बहुत महत्वपूर्ण है। मानव ग्इंगिवल ऊतक से ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं का अलगाव और संस्कृति ग्इंगिवल एपिथेलियम का अध्ययन करने के लिए आवश्यक पहला कदम है। इस तरह की प्रक्रिया के लिए बुनियादी संचालन की आवश्यकता होती है जैसे ऊतक इंजीनियरिंग के लिए बीज कोशिकाओं का उत्पादन, पीरियोडोन्टल संबंधित रोगों के इन विट्रो मॉडल, और पीरियोडोन्टल दोषों की मरम्मत के लिए सामग्री।
प्राथमिक gingival epithelial कोशिकाओं को विट्रो4में कम विभाजन दर की विशेषता है, शोधकर्ता दशकों से एक इष्टतम अलगाव और खेती विधि की तलाश कर रहे हैं। आज तक, दो अलग-अलग तकनीकें, एक प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि और एक एंजाइमेटिक विधि, आमतौर पर प्रयोगशालाओं में विट्रो4, 5में प्राथमिक gingival epithelium कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए उपयोग कियाजाताहै। प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि में कम मात्रा में ऊतक नमूनों और सरल अलगाव प्रक्रिया की आवश्यकता जैसे फायदे हैं, लेकिन इसमें लंबे समय तक संस्कृति समय और संदूषण के लिए संवेदनशीलता के नुकसान हैं5। हालांकि एंजाइमीय विधि संस्कृति के समय की आवश्यकता को छोटा करती है, दक्षता अपेक्षाकृत कम होती है और एंजाइमों और उपयोग किए जाने वाले माध्यम के आधार पर भिन्न होती है। केजरून एट अल6 ने दिखाया कि प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि, जिसके लिए उपसंस्कृति (2 सप्ताह) से पहले अधिक समय की आवश्यकता होती है, एंजाइमेटिक विधि की तुलना में gingival एपिथेलियल कोशिकाओं को बनाने के लिए अधिक सफल दिखाई दिया। हालांकि, इन दो तरीकों की तुलना करते हुए, क्लिंगबेल एट अल7 ने पाया कि एंजाइमेटिक विधि में मौखिक एपिथेलियल कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृतियों के लिए सबसे अच्छा परिणाम था, और सबसे कम समय अवधि (11.9 दिन बनाम 14.2 दिन) के भीतर इष्टतम कोशिका उपज प्राप्त करना संभव था।
इसलिए, मौखिक एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक अधिक सुविधाजनक और प्रभावी विधि विकसित करना महत्वपूर्ण था4. हमने पहले बताया कि वाई-27632 को जोड़ना, जो कि रो-संबद्ध प्रोटीन किनेज (रॉक) का अवरोधकहै, वयस्क त्वचा ऊतकों8,9,10से मानव प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं और केराटिनोसाइट्स की अलगाव प्रक्रिया को सरल बनाता है। हमने जी-माध्यम विकसित किया, एक नया वातानुकूलित टीका माध्यम जो अनायास एपिडर्मल को डर्मल कोशिकाओं से अलग करता है और प्राथमिकएपिडर्मल कोशिकाओं8,9,10के विकास और उपज का समर्थन करता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने वाई-27632 के साथ जी-माध्यम को मिलाकर gingival एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए एक नई सीरम मुक्त अलगाव और संस्कृति तकनीक विकसित की। संक्षेप में, हमारी विधि पारंपरिक दो-चरण एंजाइमेटिक विधि के सरलीकरण पर आधारित है, इसलिए हमने अपनी नई विधि की तुलना प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि से की है। यह संशोधित एंजाइमेटिक विधि gingival ऊतक से gingival epithelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक समय को काफी छोटा करती है और gingival एपिथेलियल कोशिकाओं को बनाने की दक्षता को बढ़ाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जिंडिवल ऊतक एक प्रमुख संरचना है जो पीरियोडोन्टल अखंडता और स्वास्थ्य को बनाए रखती है। Gingival epithelial कोशिकाओं की मरम्मत और पीरियोडोन्टल ऊतक के उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिकाएं हैं और वैज्ञानिक अनुसंधान और नै?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को शेंडोंग प्रांत प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ZR2019ZD36) के प्रमुख कार्यक्रम और शेंडोंग प्रांत (2019GSF108107) के प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम द्वारा X.W. के लिए समर्थित किया गया था; शेंडोंग प्रांत (2018GSF118240) के प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम जेजी के लिए; शेंडोंग प्रांत (2018WS163) की चिकित्सा और स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास परियोजना जेड एक्स, और शेंडोंग प्रांत (2019WS045) की चिकित्सा और स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास परियोजना जेएस
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
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