Summary

Isolasjon og kultur av primære humane gingival epitelceller ved hjelp av Y-27632

Published: November 06, 2021
doi:

Summary

Her presenterer vi en modifisert metode for isolasjon og kultur av menneskelige gingival epitelceller ved å legge rockhemmeren, Y-27632, til den tradisjonelle metoden. Denne metoden er enklere, mindre tidkrevende, forbedrer stamcelleegenskapene, og produserer et større antall høypotensiale epitelceller både for laboratoriet og for kliniske anvendelser.

Abstract

Gingivalvevet er den første strukturen som beskytter periodontalt vev og spiller meningsfulle roller i mange orale funksjoner. Gingival epitel er en viktig struktur av gingivalvev, spesielt i reparasjon og regenerering av periodontalt vev. Å studere funksjonene til gingival epitelceller har avgjørende vitenskapelig verdi, for eksempel å reparere orale feil og oppdage kompatibiliteten til biomaterialer. Siden humane gingival epitelceller er svært differensierte keratiniserte celler, er levetiden kort, og de er vanskelige å passere. Så langt er det bare to måter å isolere og kultur gingival epitelceller, en direkte explant metode og en enzymatisk metode. Imidlertid er tiden som kreves for å oppnå epitelceller ved hjelp av den direkte explant-metoden lengre, og celleoverlevelsesgraden til den enzymatiske metoden er lavere. Klinisk er oppkjøpet av gingivalvev begrenset, så det er nødvendig med et stabilt, effektivt og enkelt in vitro-isolasjons- og kultursystem. Vi forbedret den tradisjonelle enzymatiske metoden ved å legge til Y-27632, en Rho-assosiert kinase (ROCK) hemmer, som selektivt kan fremme veksten av epitelceller. Vår modifiserte enzymatiske metode forenkler trinnene i den tradisjonelle enzymatiske metoden og øker effektiviteten til å dyrke epitelceller, som har betydelige fordeler i forhold til den direkte explant-metoden og den enzymatiske metoden.

Introduction

Den menneskelige gingiva, den første linjeforsvarsstrukturen som beskytter periodontalt vev, er ikke bare en fysisk og kjemisk barriere1, men skiller også ut forskjellige klasser av inflammatoriske mediatorer som deltar i immunresponser og utgjør en immunbarriere2,3. Gingival epitel spiller en viktig rolle i reparasjon og regenerering av periodontalt vev. Derfor er det å studere gingival epitelets forsvar og immunitet av stor betydning for å forstå forekomsten, diagnosen og behandlingen av periodontitt. Isolasjonen og kulturen av gingival epitelceller fra humant gingivalvev er det første trinnet som kreves for å studere gingival epitelet. En slik prosedyre krever grunnleggende operasjoner som å produsere frøceller for vevsteknikk, in vitro-modeller av periodontale tilknyttede sykdommer og materialer for reparasjon av periodontale feil.

Primære gingival epitelceller er preget av en lav divisjonsrate in vitro4, forskere har lett etter en optimal isolasjons- og dyrkingsmetode i flere tiår. Til dags dato brukes to forskjellige teknikker, en direkte explant-metode og en enzymatisk metode, ofte i laboratorier for å oppnå primære gingival epitelceller in vitro4,5. Den direkte explant-metoden har fordeler som kravet om en lavere mengde vevsprøver og enkel isolasjonsprosedyre, men den har ulempene med lengre kulturtid og følsomhet for forurensning5. Selv om den enzymatiske metoden forkorter kulturtiden som kreves, er effektiviteten relativt lav og varierer avhengig av enzymer og medium som brukes. Kedjarune et al.6 viste at den direkte explant-metoden, som krever mer tid før subkultur (2 uker), så ut til å være mer vellykket for å dyrke gingival epitelceller sammenlignet med den enzymatiske metoden. Men sammenlignet med disse to metodene fant Klingbeil et al.7 at den enzymatiske metoden hadde de beste resultatene for primærkulturer av orale epitelceller, og det var mulig å oppnå det optimale celleutbyttet innen kortest tidsperiode (11,9 dager versus 14,2 dager).

Derfor var det viktig å utvikle en mer praktisk og effektiv metode for isolasjon og kultur av orale epitelceller4. Vi har tidligere rapportert at tilsetning av Y-27632, en hemmer av Rho-assosiert proteinkinase (ROCK), forenkler isolasjonsprosedyren til humane primære epidermale celler og keratinocytter fra voksent hudvev8,9,10. Vi utviklet G-medium, et nytt betinget inokulasjonsmedium som spontant skiller epidermal fra dermale celler og støtter vekst og utbytte av primære epidermale celler8,9,10. I den nåværende studien utviklet vi en ny serumfri isolasjons- og kulturteknikk for gingival epitelceller ved å kombinere G-medium med Y-27632. I hovedsak er vår metode basert på en forenkling av den tradisjonelle to-trinns enzymatiske metoden, så vi sammenlignet vår nye metode med den direkte explant-metoden. Denne modifiserte enzymatiske metoden forkorter betydelig tiden som kreves for å skille gingival epitelceller fra gingivalvev og øker effektiviteten av å dyrke gingival epitelceller.

Protocol

Humant vev som brukes i denne protokollen er ferske voksne gingivalvev kassert fra ekstraksjoner av berørte tenner i Maxillofacial Surgery Department i henhold til retningslinjene fra institusjonens humane forskningsetiske komité (protokollnr. GR201711, Dato: 02-27-2017). 1. Forberedelser Samle ferske voksne gingivalvev i 15 ml rør som inneholder 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) supplert med 3% penicillin/streptomycin (P/S) og hold vevet ved 4 °C.MERK: Behan…

Representative Results

Figur 1 viser et skjematisk diagram over metoden for direkte utvisning og den modifiserte enzymatiske metoden. Den direkte explant-metoden trenger ikke noe fordøyelsesenzym under hele prosessen. I motsetning trenger den tradisjonelle enzymatiske metoden vanligvis to sett med fordøyelsesenzymer, dispase og kollagenase, for å skille epitelplaten fra det underliggende fibroblastlaget, og deretter trypsin for å frigjøre epitelcellene i suspensjon. Vår nye metode utelater trinnet for separa…

Discussion

Gingivalvevet er en nøkkelstruktur som opprettholder periodontal integritet og helse. Gingival epitelceller har betydelige roller i reparasjon og regenerering av periodontalt vev og kan brukes i vitenskapelig forskning og kliniske anvendelser og relaterte felt, inkludert oral biologi, farmakologi, toksikologi og orale slimhinnemangler18. Derfor er det nødvendig å utvikle en stabil og effektiv metode for å høste orale epitelceller19. Primære epitelceller er en slags fu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) og Key Research and Development Program of Shandong Province (2019GSF108107) til X.W.; Det viktigste forsknings- og utviklingsprogrammet i Shandong-provinsen (2018GSF118240) til J.G.; Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2018WS163) til Z.X., og Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2019WS045) til J.S.

Materials

Names Abbreviations & Comments
Countess automated cell counter Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. BBA0218AC Automatic cell counting
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubation
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50 ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifugation
1.5 ml microcentrifuge Tubes KIRGEN 190691J For cell digestion
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Gingival epithelial  cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HGGEPCs dissociation
Dilution Medium Life Technologies 50-9701 For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HGGEPCs isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HGGEPCs isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Gene Operation IAD1011 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Dojindo Molecular Technologies CK04 For Cell proliferation assay
Rabbit Anti-Human CK18 Abcam ab82254 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 Abcam ab76318 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts
Rabbit Anti-Human pan-ck BD 550951 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-Ki67 Abcam 15580 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-p63 Biolegend 619002 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-p75NGFR Abcam ab52987 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs

References

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
  3. Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
  4. Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
  5. Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
  6. Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
  7. Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
  8. Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
  9. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
  11. Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
  12. Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
  13. Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
  14. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  15. Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
  16. Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
  17. Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
  18. Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
  19. Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
  20. Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
  21. Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
  22. Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
  23. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
  24. Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
  25. Smola, H., Krieg, T., Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. . The keratinocyte handbook. 375, 311 (1994).
  26. Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
  27. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
  28. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
  29. Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
  30. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
  31. Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
  32. Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
check_url/62978?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Xie, Z., Shi, J., Zong, M., Xu, Q., Liu, C., Wen, J., Zhang, Q., Liu, P., Liu, G., Guo, J., Wu, X. Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632. J. Vis. Exp. (177), e62978, doi:10.3791/62978 (2021).

View Video