Détermination de la dépense énergétique basale et de la capacité des adipocytes thermogéniques à dépenser de l’énergie chez les souris obèses
Summary
Ce manuscrit décrit un protocole pour mesurer le taux métabolique basal et la capacité oxydative des adipocytes thermogéniques chez les souris obèses.
Abstract
Les mesures de la dépense énergétique sont nécessaires pour comprendre comment les changements dans le métabolisme peuvent conduire à l’obésité. La dépense énergétique basale peut être déterminée chez la souris en mesurant la consommation d’oxygène du corps entier, la production de CO2 et l’activité physique à l’aide de cages métaboliques. Les adipocytes thermogéniques bruns/beiges (BA) contribuent de manière significative à la dépense énergétique des rongeurs, en particulier à basse température ambiante. Ici, les mesures de la dépense énergétique basale et de la capacité totale de BA à dépenser de l’énergie chez les souris obèses sont décrites dans deux protocoles détaillés: le premier expliquant comment mettre en place le test pour mesurer la dépense énergétique basale à l’aide de l’analyse de la covariance (ANCOVA), une analyse nécessaire étant donné que la dépense énergétique co-varie avec la masse corporelle. Le deuxième protocole décrit comment mesurer la capacité de dépense énergétique BA in vivo chez la souris. Cette procédure implique une anesthésie, nécessaire pour limiter les dépenses causées par l’activité physique, suivie de l’injection d’agoniste bêta3-adrénergique, CL-316,243, qui active la dépense énergétique en BA. Ces deux protocoles et leurs limites sont décrits de manière suffisamment détaillée pour permettre une première expérience réussie.
Introduction
Le métabolisme peut être défini comme l’intégration des réactions biochimiques responsables de l’absorption, du stockage, de la transformation et de la dégradation des nutriments que les cellules utilisent pour se développer et remplir leurs fonctions. Les réactions métaboliques transforment l’énergie contenue dans les nutriments en une forme qui peut être utilisée par les cellules pour synthétiser de nouvelles molécules et exécuter des travaux. Ces réactions biochimiques sont intrinsèquement inefficaces pour transformer cette énergie en une forme utilisable pour soutenir la vie1. Une telle inefficacité entraîne une dissipation d’énergie sous forme de chaleur, cette production de chaleur étant utilisée pour quantifier le taux métabolique standard (TMS) d’un organisme1. La condition standard était classiquement définie comme la production de chaleur se produisant chez un adulte éveillé mais au repos, n’ingérant ni digérant les aliments, à la thermoneutralité et sans stress1. Le taux métabolique basal (BMR) ou dépense énergétique basale chez la souris est appelé SMR, mais chez les individus qui ingèrent et digèrent des aliments sous un léger stress thermique (températures ambiantes de 21 à 22 ° C)1. Les défis et les difficultés de la mesure directe de la production de chaleur ont fait de la calorimétrie indirecte, à savoir le calcul de la production de chaleur à partir de mesures de consommation d’oxygène, l’approche la plus populaire pour déterminer le BMR. Le calcul du BMR à partir de la consommation d’oxygène est possible car l’oxydation des nutriments par les mitochondries pour synthétiser l’ATP est responsable de 72% de l’oxygène total consommé dans un organisme, 8% de la consommation totale d’oxygène se produisant également dans les mitochondries mais sans générer d’ATP (respiration non couplée)1. La majorité des 20 % restants de l’oxygène consommé peut être attribuée à l’oxydation des nutriments dans d’autres emplacements subcellulaires (oxydation des acides gras peroxysomaux), aux processus anabolisants et à la formation d’espèces réactives de l’oxygène1. Ainsi, en 1907, Lusk a établi une équation, basée sur des mesures empiriques, largement utilisée pour transformer la consommation d’oxygène et la production de CO2 en dissipation d’énergie sous forme de chaleur. Chez l’homme, le cerveau représente environ 25% du BMR, le système musculo-squelettique environ 18,4%, le foie environ 20%, le cœur environ 10% et le tissu adipeux environ 3 à 7%2. Chez la souris, la contribution tissulaire à la BMR est légèrement différente, le cerveau représentant ~6,5%, le muscle squelettique ~13%, le foie ~52%, le cœur ~3,7% et le tissu adipeux ~5%3.
Remarquablement, les réactions biochimiques définissant le BMR ne sont pas fixes et changent en réponse à différents besoins, tels que le travail externe (activité physique), le développement (croissance des tissus), les stress internes (contre-infections, blessures, renouvellement tissulaire) et les changements de température ambiante (défense contre le froid)1. Certains organismes recrutent activement des processus pour générer de la chaleur lors de l’exposition au froid, ce qui implique que la chaleur produite par le métabolisme n’est pas seulement un sous-produit accidentel. Au lieu de cela, l’évolution a sélectionné des mécanismes de régulation qui pourraient spécifiquement réguler à la hausse la production de chaleur en modifiant le taux de réactions métaboliques1. Ainsi, ces mêmes mesures de consommation d’oxygène peuvent être utilisées pour déterminer la capacité d’un organisme à générer de la chaleur en réponse au froid.
Deux processus majeurs contribuent à la production de chaleur lors de l’exposition au froid. Le premier est le frisson, qui génère de la chaleur en augmentant la phosphorylation oxydative mitochondriale et la glycolyse dans les muscles pour couvrir le travail physique effectué par contraction musculaire involontaire. Par conséquent, l’exposition au froid augmentera la consommation d’oxygène dans les muscles1. La seconde est la thermogenèse non frissonnante, qui se produit par une augmentation de la consommation d’oxygène dans les adipocytes bruns et beiges (BA). La dissipation de l’énergie en chaleur dans BA est médiée par la protéine de découplage mitochondrial 1 (UCP1), qui permet la rentrée des protons dans la matrice mitochondriale, diminuant ainsi le gradient de protons mitochondriaux. La dissipation du gradient de protons mitochondriaux par UCP1 augmente la production de chaleur par l’élévation du transfert d’électrons et de la consommation d’oxygène et l’énergie libérée par la dissipation de protons en soi sans générer d’ATP (découplé). De plus, le BA thermogénique peut recruter des mécanismes supplémentaires qui augmentent la consommation d’oxygène sans provoquer une dissipation importante dans le gradient de protons, en activant des cycles futiles de synthèse et de consommation d’ATP oxydatif. Les cages métaboliques décrites ici, à savoir le système CLAMS-Oxymax de Columbus Instruments, offrent la possibilité de mesurer la dépense énergétique à différentes températures ambiantes. Cependant, pour déterminer la capacité thermogénique BA à l’aide de mesures de la consommation d’oxygène du corps entier, il faut: (1) éliminer la contribution des frissons et d’autres processus métaboliques non BA à la dépense énergétique, et (2) activer spécifiquement l’activité thermogénique BA in vivo. Ainsi, un deuxième protocole décrit comment activer sélectivement le BA in vivo en utilisant la pharmacologie chez des souris anesthésiées à la thermoneutralité (30 °C), l’anesthésie et la thermoneutralité limitant d’autres processus thermogéniques non BA (c.-à-d. l’activité physique). La stratégie pharmacologique pour activer ba consiste à traiter des souris avec l’agoniste des récepteurs β3-adrénergiques CL-316,246. La raison en est que l’exposition au froid favorise une réponse sympathique libérant de la noradrénaline pour activer les récepteurs β-adrénergiques dans BA, qui active uCP1 et l’oxydation des graisses. De plus, l’expression des récepteurs β3-adrénergiques est fortement enrichie dans le tissu adipeux chez la souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
La calorimétrie indirecte est utilisée depuis des années pour évaluer la dépense énergétique de l’ensemble du corps4. Ce protocole décrit ici fournit une méthode simple pour mesurer le taux métabolique de base et déterminer la capacité thermogénique BA in vivo à l’aide de cages métaboliques.
La méthode de calorimétrie indirecte décrite ici confirme que la division des valeurs de dépense énergétique par les valeurs de poids corporel peut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML est financé par le département de médecine de l’UCLA, des subventions pilotes de P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) et P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
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