Определение базального расхода энергии и способности термогенных адипоцитов расходовать энергию у мышей с ожирением
Summary
В этой рукописи описывается протокол измерения базальной скорости метаболизма и окислительной способности термогенных адипоцитов у мышей с ожирением.
Abstract
Измерения расхода энергии необходимы, чтобы понять, как изменения в метаболизме могут привести к ожирению. Базальный расход энергии может быть определен у мышей путем измерения потребления кислорода всем телом, производства CO2 и физической активности с использованием метаболических клеток. Термогенные коричневые/бежевые адипоциты (БА) вносят значительный вклад в расход энергии грызунов, особенно при низких температурах окружающей среды. Здесь измерения базального расхода энергии и общей способности БА расходовать энергию у мышей с ожирением описаны в двух подробных протоколах: первый объясняет, как настроить анализ для измерения базального расхода энергии с использованием анализа ковариации (ANCOVA), необходимого анализа, учитывая, что расход энергии изменяется вместе с массой тела. Второй протокол описывает, как измерить емкость расхода энергии BA in vivo у мышей. Эта процедура включает в себя анестезию, необходимую для ограничения расходов, вызванных физической активностью, с последующей инъекцией бета3-адренергического агониста CL-316,243, который активирует расход энергии при БА. Эти два протокола и их ограничения описаны достаточно подробно, чтобы обеспечить успешный первый эксперимент.
Introduction
Метаболизм можно определить как интеграцию биохимических реакций, ответственных за поглощение, хранение, трансформацию и распад питательных веществ, которые клетки используют для роста и выполнения своих функций. Метаболические реакции преобразуют энергию, содержащуюся в питательных веществах, в форму, которая может быть использована клетками для синтеза новых молекул и выполнения работы. Эти биохимические реакции по своей сути неэффективны в преобразовании этой энергии в пригодную для использования форму для поддержания жизни1. Такая неэффективность приводит к рассеиванию энергии в виде тепла, причем это производство тепла используется для количественной оценки стандартной скорости метаболизма (SMR) организма1. Стандартное состояние было классически определено как производство тепла, происходящее у бодрствующего, но отдыхающего взрослого человека, не глотающего и не переваривающего пищу, при термонейтральности и без какого-либо стресса1. Базальная скорость метаболизма (BMR) или базальный расход энергии у мышей называется SMR, но у людей, принимающих и переваривающих пищу при легком тепловом стрессе (температура окружающей среды 21-22 ° C) 1. Проблемы и трудности непосредственного измерения производства тепла сделали косвенную калориметрию, а именно расчет производства тепла из измерений потребления кислорода, наиболее популярным подходом к определению БМР. Расчет BMR по потреблению кислорода возможен, потому что окисление питательных веществ митохондриями для синтеза АТФ отвечает за 72% общего кислорода, потребляемого в организме, причем 8% общего потребления кислорода также происходит в митохондриях, но без генерации АТФ (несвязанное дыхание)1. Большая часть оставшихся 20% потребляемого кислорода может быть отнесена к окислению питательных веществ в других субклеточных местах (окисление пероксисомальных жирных кислот), анаболическим процессам и образованию активных форм кислорода1. Так, в 1907 году Ласк установил уравнение, основанное на эмпирических измерениях, широко используемое для преобразования потребления кислорода и производства CO2 в рассеивание энергии в виде тепла. У людей мозг составляет ~ 25% BMR, опорно-двигательный аппарат ~ 18,4%, печень ~ 20 %, сердце ~ 10% и жировая ткань ~ 3-7%2. У мышей вклад ткани в BMR немного отличается: мозг составляет ~ 6,5%, скелетные мышцы ~ 13%, печень ~ 52%, сердце ~ 3,7% и жировая ткань ~ 5%3.
Примечательно, что биохимические реакции, определяющие BMR, не являются фиксированными и изменяются в ответ на различные потребности, такие как внешняя работа (физическая активность), развитие (рост тканей), внутренние стрессы (противодействие инфекциям, травмам, обороту тканей) и изменения температуры окружающей среды (защита от холода)1. Некоторые организмы активно рекрутируют процессы для генерации тепла при воздействии холода, подразумевая, что тепло, производимое метаболизмом, не является просто случайным побочным продуктом. Вместо этого эволюция выбрала регуляторные механизмы, которые могли бы специфически повышать выработку тепла, изменяя скорость метаболических реакций1. Таким образом, эти же измерения потребления кислорода могут быть использованы для определения способности организма генерировать тепло в ответ на холод.
Два основных процесса способствуют выделению тепла при воздействии холода. Первым из них является дрожь, которая генерирует тепло путем увеличения митохондриального окислительного фосфорилирования и гликолиза в мышцах, чтобы покрыть физическую работу, выполняемую непроизвольным сокращением мышц. Поэтому воздействие холода увеличит потребление кислорода в мышцах1. Второй — недрожащий термогенез, который происходит за счет увеличения потребления кислорода в коричневых и бежевых адипоцитах (БА). Рассеивание энергии в тепло в БА опосредовано митохондриальным разъединяющим белком 1 (UCP1), который позволяет протону возвращаться в митохондриальный матрикс, уменьшая митохондриальный протонный градиент. Диссипация митохондриального градиента протонов UCP1 увеличивает производство тепла за счет повышения переноса электронов и потребления кислорода, а также энергии, высвобождаемой при рассеивании протонов как таковом без генерации АТФ (несвязанной). Кроме того, термогенный БА может вызывать дополнительные механизмы, которые повышают потребление кислорода, не вызывая большого рассеивания в протонном градиенте, активируя бесполезные циклы окислительного синтеза и потребления АТФ. Метаболические клетки, описанные здесь, а именно система CLAMS-Oxymax от Columbus Instruments, предлагают возможность измерять расход энергии при различных температурах окружающей среды. Однако, чтобы определить термогенную способность БА с помощью измерений потребления кислорода всем телом, необходимо: (1) устранить вклад дрожи и других метаболических процессов, не связанных с БА, в расход энергии и (2) специфически активировать термогенную активность БА in vivo. Таким образом, второй протокол описывает, как избирательно активировать BA in vivo с использованием фармакологии у обезболенных мышей при термонейтральности (30 ° C), с анестезией и термонейтральностью, ограничивающей другие термогенные процессы без БА (т. Е. Физическая активность). Фармакологическая стратегия активации БА заключается в лечении мышей агонистом β3-адренергических рецепторов CL-316,246. Причина в том, что воздействие холода способствует симпатическому ответу, высвобождая норадреналин для активации β-адренорецепторов в БА, что активирует UCP1 и окисление жиров. Кроме того, экспрессия β3-адренергических рецепторов высоко обогащена жировой тканью у мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Непрямая калориметрия используется в течение многих лет для оценки расхода энергии всего тела4. Этот протокол, описанный в настоящем описании, обеспечивает простой способ измерения базальной скорости метаболизма и определения термогенной способности BA in vivo с исполь?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML финансируется Департаментом медицины в UCLA, пилотные гранты от P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) и P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
- Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159 (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
- Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
- Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
- Assali, E. A., et al. NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue. Nature Communication. 11 (1), 3347 (2020).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).
- Schena, G., Caplan, M. J. Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask). Cells. 8 (4), 357 (2019).
- Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).
- Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958 (2017).
