Determinazione del dispendio energetico basale e della capacità degli adipociti termogenici di spendere energia nei topi obesi
Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo per misurare il metabolismo basale e la capacità ossidativa degli adipociti termogenici nei topi obesi.
Abstract
Le misurazioni del dispendio energetico sono necessarie per capire come i cambiamenti nel metabolismo possono portare all’obesità. Il dispendio energetico basale può essere determinato nei topi misurando il consumo di ossigeno in tutto il corpo, la produzione di CO2 e l’attività fisica utilizzando gabbie metaboliche. Gli adipociti termogenici marrone/beige (BA) contribuiscono in modo significativo al dispendio energetico dei roditori, in particolare a basse temperature ambiente. Qui, le misurazioni del dispendio energetico basale e della capacità totale di BA di spendere energia nei topi obesi sono descritte in due protocolli dettagliati: il primo spiega come impostare il test per misurare il dispendio energetico basale utilizzando l’analisi della covarianza (ANCOVA), un’analisi necessaria dato che il dispendio energetico co-varia con la massa corporea. Il secondo protocollo descrive come misurare la capacità di dispendio energetico di BA in vivo nei topi. Questa procedura prevede l’anestesia, necessaria per limitare la spesa causata dall’attività fisica, seguita dall’iniezione di agonista beta3-adrenergico, CL-316.243, che attiva il dispendio energetico in BA. Questi due protocolli e le loro limitazioni sono descritti in modo sufficientemente dettagliato da consentire un primo esperimento di successo.
Introduction
Il metabolismo può essere definito come l’integrazione delle reazioni biochimiche responsabili dell’assorbimento, dello stoccaggio, della trasformazione e della rottura dei nutrienti che le cellule usano per crescere e svolgere le loro funzioni. Le reazioni metaboliche trasformano l’energia contenuta nei nutrienti in una forma che può essere utilizzata dalle cellule per sintetizzare nuove molecole ed eseguire il lavoro. Queste reazioni biochimiche sono intrinsecamente inefficienti nel trasformare questa energia in una forma utilizzabile per sostenere la vita1. Tale inefficienza si traduce in dissipazione di energia sotto forma di calore, con questa produzione di calore utilizzata per quantificare il tasso metabolico standard (SMR) di un organismo1. La condizione standard è stata classicamente definita come produzione di calore che si verifica in un adulto sveglio ma a riposo, non ingerendo o digerendo cibo, a termoneutralità e senza alcuno stress1. Il metabolismo basale (BMR) o dispendio energetico basale nei topi è indicato come SMR, ma negli individui che ingeriscono e digeriscono il cibo sotto lieve stress termico (temperature ambiente 21-22 ° C)1. Le sfide e le difficoltà di misurare direttamente la produzione di calore hanno reso la calorimetria indiretta, vale a dire il calcolo della produzione di calore dalle misurazioni del consumo di ossigeno, l’approccio più popolare per determinare il BMR. Il calcolo del BMR dal consumo di ossigeno è possibile perché l’ossidazione dei nutrienti da parte dei mitocondri per sintetizzare l’ATP è responsabile del 72% dell’ossigeno totale consumato in un organismo, con l’8% del consumo totale di ossigeno che si verifica anche nei mitocondri ma senza generare ATP (respirazione disaccoppiata)1. La maggior parte del restante 20% dell’ossigeno consumato può essere attribuita all’ossidazione dei nutrienti in altre posizioni subcellulari (ossidazione degli acidi grassi perossisomiali), ai processi anabolici e alla formazione di specie reattive dell’ossigeno1. Così, nel 1907, Lusk stabilì un’equazione, basata su misurazioni empiriche, ampiamente utilizzata per trasformare il consumo di ossigeno e la produzione di CO2 in dissipazione di energia come calore. Negli esseri umani, il cervello rappresenta ~ 25% del BMR, il sistema muscolo-scheletrico per ~ 18,4%, il fegato per ~ 20%, il cuore per ~ 10% e il tessuto adiposo per ~ 3-7% 2. Nei topi, il contributo tissutale al BMR è leggermente diverso, con il cervello che rappresenta ~ 6,5%, il muscolo scheletrico ~ 13%, il fegato ~ 52%, il cuore ~ 3,7% e il tessuto adiposo ~ 5% 3.
Sorprendentemente, le reazioni biochimiche che definiscono il BMR non sono fisse e cambiano in risposta a diverse esigenze, come il lavoro esterno (attività fisica), lo sviluppo (crescita dei tessuti), gli stress interni (contrastando infezioni, lesioni, turnover dei tessuti) e i cambiamenti nella temperatura ambiente (difesa dal freddo)1. Alcuni organismi reclutano attivamente processi per generare calore nell’esposizione al freddo, il che implica che il calore prodotto dal metabolismo non è solo un sottoprodotto accidentale. Invece, l’evoluzione ha selezionato meccanismi regolatori che potrebbero specificamente sovraregolare la produzione di calore modificando il tasso di reazioni metaboliche1. Pertanto, queste stesse misurazioni del consumo di ossigeno possono essere utilizzate per determinare la capacità di un organismo di generare calore in risposta al freddo.
Due processi principali contribuiscono alla generazione di calore in caso di esposizione al freddo. Il primo è il brivido, che genera calore aumentando la fosforilazione ossidativa mitocondriale e la glicolisi nel muscolo per coprire il lavoro fisico svolto dalla contrazione muscolare involontaria. Pertanto, l’esposizione al freddo aumenterà il consumo di ossigeno nei muscoli1. Il secondo è la termogenesi non da brividi, che si verifica attraverso un aumento del consumo di ossigeno negli adipociti marroni e beige (BA). La dissipazione di energia in calore in BA è mediata dalla proteina di disaccoppiamento mitocondriale 1 (UCP1), che consente il rientro del protone nella matrice mitocondriale, diminuendo il gradiente protonico mitocondriale. La dissipazione del gradiente protonico mitocondriale da parte di UCP1 aumenta la produzione di calore mediante l’elevazione del trasferimento di elettroni e del consumo di ossigeno e l’energia rilasciata dalla dissipazione protonica di per sé senza generare ATP (disaccoppiato). Inoltre, il BA termogenico può reclutare meccanismi aggiuntivi che elevano il consumo di ossigeno senza causare una grande dissipazione nel gradiente protonico, attivando futili cicli di sintesi e consumo ossidativo di ATP. Le gabbie metaboliche qui descritte, ovvero il sistema CLAMS-Oxymax di Columbus Instruments, offrono la possibilità di misurare il dispendio energetico a diverse temperature ambiente. Tuttavia, per determinare la capacità termogenica di BA utilizzando misurazioni del consumo di ossigeno in tutto il corpo, è necessario: (1) eliminare il contributo dei brividi e di altri processi metabolici non BA al dispendio energetico e (2) attivare specificamente l’attività termogenica BA in vivo. Pertanto, un secondo protocollo descrive come attivare selettivamente IL BA in vivo utilizzando la farmacologia in topi anestetizzati a termoneutralità (30 °C), con anestesia e termoneutralità che limitano altri processi termogenici non BA (cioè l’attività fisica). La strategia farmacologica per attivare il BA è il trattamento dei topi con l’agonista del recettore β3-adrenergico CL-316.246. Il motivo è che l’esposizione al freddo promuove una risposta simpatica che rilascia noradrenalina per attivare i recettori β-adrenergici in BA, che attiva UCP1 e ossidazione dei grassi. Inoltre, l’espressione del recettore β3-adrenergico è altamente arricchita nel tessuto adiposo nei topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La calorimetria indiretta è stata utilizzata per anni per valutare il dispendio energetico di tutto il corpo4. Questo protocollo qui descritto fornisce un metodo semplice per misurare il metabolismo basale e determinare la capacità termogenica di BA in vivo utilizzando gabbie metaboliche.
Il metodo della calorimetria indiretta qui descritto conferma che dividere i valori di dispendio energetico per i valori del peso corporeo può essere fuorviante. Ad esempio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML è finanziato dal Dipartimento di Medicina dell’UCLA, sovvenzioni pilota da P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) e P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
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