비만 마우스에 있는 에너지를 소모하기 위하여 기저 에너지 지출 및 열발생 성 지방세포의 용량을 결정합니다
Summary
이 원고는 비만 마우스에 있는 열발생 성 분포세포의 기저 대사 속도 및 산화 용량을 측정하는 프로토콜을 기술합니다.
Abstract
에너지 지출 측정은 신진 대사의 변화가 비만으로 이어질 수있는 방법을 이해하는 데 필요합니다. 기저 에너지 지출은 대사 케이지를 사용하여 전신 산소 소비, CO2 생산 및 신체 활동을 측정하여 마우스에서 결정될 수 있다. 열발생성 갈색/베이지색 지방세포(BA)는 설치류 에너지 지출, 특히 낮은 주변 온도에서 크게 기여합니다. 여기서, 비만 마우스에서 에너지를 소비하기 위한 기저 에너지 지출 및 총 BA 용량의 측정은 두 가지 상세한 프로토콜에 설명되어 있습니다: 공변성(ANCOVA)의 분석을 사용하여 기저 에너지 지출을 측정하는 분석을 설정하는 방법을 최초로 설명하는 것, 에너지 지출이 체질량과 공동 다르다는 점을 감안할 때 필요한 분석. 두 번째 프로토콜은 마우스 에서 생체 내에서 BA 에너지 지출 용량을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 절차는 신체 활동에 의한 지출을 제한하는 데 필요한 마취를 포함하고, BA에서 에너지 지출을 활성화하는 beta3-adrenergic 작용제, CL-316,243의 주입에 선행됩니다. 이 두 프로토콜과 그 제한은 성공적인 첫 번째 실험을 허용하기에 충분한 세부 사항으로 설명됩니다.
Introduction
신진 대사는 세포가 성장하고 그들의 기능을 능력을 능력을 발휘하기 위하여 이용하는 영양 섭취, 저장, 변환 및 고장에 책임 있는 생화학 반응의 통합으로 정의될 수 있습니다. 대사 반응은 새로운 분자를 합성하고 작동을 실행하는 세포에 의해 사용될 수있는 형태로 영양소에 포함 된 에너지를 변환합니다. 이러한 생화학 반응은 생명을 유지하기 위해 사용 가능한 형태로이 에너지를 변환본질적으로 비효율적입니다1. 이러한 비효율성은 열 의 형태로 에너지 소멸을 초래하며,이 열 생산은 유기체1의 표준 대사 속도 (SMR)를 정량화하는 데 사용됩니다. 표준 조건은 고전적으로 열 중성에서 또는 어떤 스트레스없이, 음식을 섭취하거나 소화하지, 깨어 있지만 휴식 성인으로 정의되었다1. 마우스의 기초 대사 속도(BMR) 또는 기저 에너지 지출은 SMR로 불리지만 온화한 열 스트레스(주변 온도 21-22°C)에서 음식을 섭취하고 소화하는 개인에게 있다. 간접 열량측정, 즉 산소 소비 측정에서 열 생산을 계산하는 열 생산을 직접 측정하는 문제와 어려움은 BMR을 결정하는 가장 인기있는 접근 방식이 됩니다. 미토콘드리아에 의한 영양소의 산화가 유기체에서 소비되는 총 산소의 72%를 담당하기 때문에 산소 소비로부터 BMR을 계산할 수 있으며, 총 산소 소비량의 8%는 미토콘드리아에서 발생하지만 ATP(분리되지 않은 호흡)를 생성하지 않고 있습니다. 나머지 20%의 나머지 20%의 산소는 다른 세포외 위치(과산화석 지방산 산화), 단백 동화 과정 및 반응성 산소 종 형성1의 영양소 산화에 기인할 수 있다. 따라서 1907년 Lusk는 산소 소비와 CO2 생산을 열로 에너지 소멸으로 변환하는 데 널리 사용되는 경험적 측정을 기반으로 방정식을 확립했습니다. 인간에서, 뇌는 BMR의 ~25%, 근골격계를 ~18.4%, 간 ~20%, 심장 ~10%, ~3-7%2의 지방 조직을 차지한다. 마우스에서 BMR에 대한 조직 기여도는 뇌가 ~6.5%, 골격 근육 ~13%, 간 ~52%, 심장 ~3.7%, 및 지방 조직 ~5%3을 나타내는 약간 다릅니다.
놀랍게도, BMR을 정의하는 생화학 반응은 외부 작업(신체 활동), 발달(조직 성장), 내부 스트레스(감염, 부상, 조직 회전율 에 대응하는 것), 주변 온도(콜드 디펜스)1과 같은 다른 요구에 반응하여 고정되지 않고 변화한다. 일부 유기체는 신진 대사에 의해 생성 된 열이 단지 우발적 인 부산물이 아니라는 것을 암시, 차가운 노출에 열을 생성하는 과정을 적극적으로 모집. 대신, 진화는 대사 반응의 비율을 변경해서 열 생산을 구체적으로 강화할 수 있는 규제 메커니즘을 선택했습니다11. 따라서, 이러한 동일한 산소 소비 측정은 감기에 대응하여 열을 생성하는 유기체의 용량을 결정하는 데 사용될 수 있다.
두 가지 주요 프로세스는 차가운 노출 시 열 생성에 기여합니다. 첫 번째는 떨리는 것으로, 미토콘드리아 산화 인산화및 근육의 글리코리시스를 증가시켜 비자발적 근육 수축에 의해 수행되는 물리적 인 작업을 커버함으로써 열을 생성합니다. 따라서, 감기 노출은 근육에서 산소 소비를 증가시킬 것이다1. 두 번째는 갈색과 베이지 색 지방 (BA)에서 산소 소비의 증가를 통해 발생하는 비 떨리는 열발생이다. BA에서 열로 에너지를 방출하는 것은 미토콘드리아 분리 단백질 1 (UCP1)에 의해 중재되어 양성자가 미토콘드리아 매트릭스로 재진입할 수 있게하여 미토콘드리아 양성자 그라데이션을 감소시다. UCP1에 의한 미토콘드리아 양성자 그라데이션의 방출은 ATP(분리되지 않은)를 생성하지 않고 전자 전달 및 산소 소비및 양성자 방출에너지 의 고도에 의한 열 생산을 증가시킨다. 더욱이, 열발생적인 BA는 무이성 산화 ATP 합성 및 소비 주기를 활성화하여 양성자 그라데이션에서 큰 방출을 일으키지 않고 산소 소비를 높이는 추가 메커니즘을 모집할 수 있다. 여기에 설명 된 신진 대사 케이지, 즉 콜럼버스 인스트루먼트의 CLAMS-Oxymax 시스템은 다른 주변 온도에서 에너지 지출을 측정 할 수있는 가능성을 제공합니다. 그러나, 전신 산소 소비 측정을 사용하여 BA 열발생 용량을 결정하기 위해, 하나는 다음과 같은 요구: (1) 에너지 지출에 떨기의 기여를 제거하고, (2) 특별히 생체 내에서 BA 열발생 활성을 활성화. 따라서, 제2 프로토콜은 다른 비BA 열발생 공정(즉, 신체 활동)을 제한하는 마취 및 열중성으로 열중성(30°C)에서 마취 및 열중성으로 마취및 열중성으로 마취된 마우스에서 약리학을 사용하여 생체 내에서 BA를 선택적으로 활성화시키는 방법을 설명합니다. BA를 활성화하기 위한 약리학적 전략은 β3-아드레너기믹 수용체 작용제 CL-316,246으로 마우스를 치료하고 있다. 그 이유는 감기 노출이 UCP1과 지방 산화를 활성화하는 BA에서 β-adrenergic 수용체를 활성화하기 위하여 노르를 풀어 놓는 공감 반응을 승진시키기 때문입니다. 더욱이, β3-아드레인기 수용체 발현은 마우스내 지방 조직에서 매우 농축된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
간접 열량은 전신 에너지 지출을 평가하기 위해 수년 동안 사용되어 왔습니다4. 본 명세서에 기재된 이 프로토콜은 대사 케이지를 사용하여 생체내에서 기저 대사 속도를 측정하고 BA 열발생 용량을 결정하는 간단한 방법을 제공한다.
여기에 설명된 간접 열량법은 에너지 지출 값을 체중 값으로 나누는 것이 오해의 소지가 있음을 확인합니다. 예를 들?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML은 UCLA의 의학부에 의해 지원, P30 DK 41301 (UCLA : DDRC NIH) 및 P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC)에서 파일럿 보조금.
Materials
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
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