Bestimmung des basalen Energieverbrauchs und der Fähigkeit thermogener Adipozyten, Energie bei übergewichtigen Mäusen zu verbrauchen
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Messung des Grundumsatzes und der oxidativen Kapazität von thermogenen Adipozyten bei übergewichtigen Mäusen.
Abstract
Messungen des Energieverbrauchs sind notwendig, um zu verstehen, wie Veränderungen im Stoffwechsel zu Fettleibigkeit führen können. Der basale Energieverbrauch kann bei Mäusen bestimmt werden, indem der Sauerstoffverbrauch des ganzen Körpers, die CO2-Produktion und die körperliche Aktivität mit Hilfe von Stoffwechselkäfigen gemessen werden. Thermogene braune/beige Adipozyten (BA) tragen erheblich zum Energieverbrauch von Nagetieren bei, insbesondere bei niedrigen Umgebungstemperaturen. Hier werden Messungen des basalen Energieverbrauchs und der gesamten BA-Kapazität, Energie bei übergewichtigen Mäusen zu verbrauchen, in zwei detaillierten Protokollen beschrieben: Das erste erklärt, wie man den Assay zur Messung des basalen Energieverbrauchs mithilfe der Analyse der Kovarianz (ANCOVA) einrichtet, eine notwendige Analyse angesichts der Tatsache, dass der Energieverbrauch mit der Körpermasse variiert. Das zweite Protokoll beschreibt, wie die BA-Energieverbrauchskapazität in vivo bei Mäusen gemessen werden kann. Dieses Verfahren beinhaltet eine Anästhesie, die erforderlich ist, um die durch körperliche Aktivität verursachten Ausgaben zu begrenzen, gefolgt von der Injektion des beta3-adrenergen Agonisten CL-316.243, der den Energieverbrauch in BA aktiviert. Diese beiden Protokolle und ihre Einschränkungen werden ausreichend detailliert beschrieben, um ein erfolgreiches erstes Experiment zu ermöglichen.
Introduction
Metabolismus kann als die Integration der biochemischen Reaktionen definiert werden, die für die Aufnahme, Speicherung, Umwandlung und den Abbau von Nährstoffen verantwortlich sind, die Zellen verwenden, um zu wachsen und ihre Funktionen zu erfüllen. Stoffwechselreaktionen wandeln die in Nährstoffen enthaltene Energie in eine Form um, die von Zellen genutzt werden kann, um neue Moleküle zu synthetisieren und Arbeit zu verrichten. Diese biochemischen Reaktionen sind von Natur aus ineffizient, um diese Energie in eine nutzbare Form zur Erhaltung des Lebens umzuwandeln1. Eine solche Ineffizienz führt zu einer Energieableitung in Form von Wärme, wobei diese Wärmeproduktion zur Quantifizierung der Standard metabolic Rate (SMR) eines Organismus verwendet wird1. Die Standardbedingung wurde klassisch definiert als Wärmeproduktion, die bei einem wachen, aber ruhenden Erwachsenen auftritt, der keine Nahrung aufnimmt oder verdaut, bei Thermoneutralität und ohne Stress1. Der Grundumsatz (BMR) oder der basale Energieverbrauch bei Mäusen wird als SMR bezeichnet, jedoch bei Personen, die unter leichtem thermischem Stress (Umgebungstemperaturen 21-22 °C) Nahrung aufnehmen und verdauen1. Die Herausforderungen und Schwierigkeiten bei der direkten Messung der Wärmeproduktion machten die indirekte Kalorimetrie, nämlich die Berechnung der Wärmeproduktion aus Sauerstoffverbrauchsmessungen, zum beliebtesten Ansatz zur Bestimmung des BMR. Die Berechnung des BMR aus dem Sauerstoffverbrauch ist möglich, da die Oxidation von Nährstoffen durch Mitochondrien zur Synthese von ATP für 72% des gesamten in einem Organismus verbrauchten Sauerstoffs verantwortlich ist, wobei 8% des gesamten Sauerstoffverbrauchs auch in Mitochondrien auftreten, jedoch ohne ATP (entkoppelte Atmung)1. Der Großteil der verbleibenden 20% des verbrauchten Sauerstoffs kann auf die Nährstoffoxidation an anderen subzellulären Orten (peroxisomale Fettsäureoxidation), anabole Prozesse und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies zurückgeführt werden1. So stellte Lusk 1907 eine Gleichung auf, die auf empirischen Messungen basierte und häufig verwendet wurde, um den Sauerstoffverbrauch und die CO2-Produktion in Energieableitung als Wärme umzuwandeln. Beim Menschen macht das Gehirn ~ 25% der BMR aus, der Bewegungsapparat ~ 18,4%, die Leber ~ 20%, das Herz ~ 10% und das Fettgewebe ~ 3-7% 2. Bei Mäusen ist der Gewebebeitrag zur BMR etwas anders, wobei das Gehirn ~ 6,5%, der Skelettmuskel ~ 13%, die Leber ~ 52%, das Herz ~ 3,7% und das Fettgewebe ~ 5% 3 ausmachen.
Bemerkenswert ist, dass die biochemischen Reaktionen, die die BMR definieren, nicht fixiert sind und sich als Reaktion auf unterschiedliche Bedürfnisse ändern, wie z.B. äußere Arbeit (körperliche Aktivität), Entwicklung (Gewebewachstum), innere Belastungen (Entgegenwirken von Infektionen, Verletzungen, Gewebeumsatz) und Veränderungen der Umgebungstemperatur (Kälteabwehr)1. Einige Organismen rekrutieren aktiv Prozesse, um Wärme bei Kälteeinwirkung zu erzeugen, was bedeutet, dass die durch den Stoffwechsel erzeugte Wärme nicht nur ein zufälliges Nebenprodukt ist. Stattdessen wählte die Evolution Regulationsmechanismen aus, die die Wärmeproduktion durch Veränderung der Geschwindigkeit der Stoffwechselreaktionen spezifisch hochregulieren könnten1. So können dieselben Sauerstoffverbrauchsmessungen verwendet werden, um die Fähigkeit eines Organismus zu bestimmen, Wärme als Reaktion auf Kälte zu erzeugen.
Zwei Hauptprozesse tragen zur Wärmeerzeugung bei Kälteeinwirkung bei. Die erste ist das Zittern, das Wärme erzeugt, indem es die mitochondriale oxidative Phosphorylierung und Glykolyse im Muskel erhöht, um die körperliche Arbeit durch unwillkürliche Muskelkontraktion zu decken. Daher erhöht die Kälteeinwirkung den Sauerstoffverbrauch in den Muskeln1. Die zweite ist die nicht zitternde Thermogenese, die durch eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs in braunen und beigen Adipozyten (BA) auftritt. Die Ableitung von Energie in Wärme in BA wird durch das mitochondriale Entkopplungsprotein 1 (UCP1) vermittelt, das den Wiedereintritt von Protonen in die mitochondriale Matrix ermöglicht und den mitochondrialen Protonengradienten verringert. Die Dissipation des mitochondrialen Protonengradienten durch UCP1 erhöht die Wärmeproduktion durch die Erhöhung des Elektronentransfers und des Sauerstoffverbrauchs und die Energie, die durch die Protonendissipation an sich freigesetzt wird, ohne ATP (entkoppelt) zu erzeugen. Darüber hinaus kann thermogenes BA zusätzliche Mechanismen rekrutieren, die den Sauerstoffverbrauch erhöhen, ohne eine große Dissipation im Protonengradienten zu verursachen, indem es sinnlose oxidative ATP-Synthese- und Verbrauchszyklen aktiviert. Die hier beschriebenen Stoffwechselkäfige, nämlich das CLAMS-Oxymax-System von Columbus Instruments, bieten die Möglichkeit, den Energieverbrauch bei unterschiedlichen Umgebungstemperaturen zu messen. Um jedoch die thermogene BA-Kapazität unter Verwendung von Ganzkörper-Sauerstoffverbrauchsmessungen zu bestimmen, muss man: (1) den Beitrag von Zittern und anderen Nicht-BA-Stoffwechselprozessen zum Energieverbrauch eliminieren und (2) die thermogene Aktivität von BA in vivo spezifisch aktivieren. So beschreibt ein zweites Protokoll, wie BA in vivo selektiv unter Verwendung der Pharmakologie in anästhesierten Mäusen bei Thermoneutralität (30 °C) aktiviert werden kann, wobei Anästhesie und Thermoneutralität andere thermogene Prozesse (d.h. körperliche Aktivität) ohne BA begrenzen. Die pharmakologische Strategie zur Aktivierung von BA ist die Behandlung von Mäusen mit dem β3-adrenergen Rezeptoragonisten CL-316,246. Der Grund dafür ist, dass Kälteexposition eine sympathische Reaktion fördert, die Noradrenalin freisetzt, um β-adrenerge Rezeptoren in BA zu aktivieren, die UCP1 und Fettoxidation aktivieren. Darüber hinaus ist die β3-adrenerge Rezeptorexpression im Fettgewebe bei Mäusen stark angereichert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die indirekte Kalorimetrie wird seit Jahren zur Beurteilung des Gesamtkörperenergieverbrauchs eingesetzt4. Dieses hierin beschriebene Protokoll bietet eine einfache Methode zur Messung des Grundumsatzes und zur Bestimmung der thermogenen BA-Kapazität in vivo unter Verwendung von Stoffwechselkäfigen.
Das hier beschriebene indirekte Kalorimetrieverfahren bestätigt, dass die Division von Energieaufwandswerten durch Körpergewichtswerte irreführend sein kann. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML wird vom Department of Medicine der UCLA finanziert, Pilotzuschüsse von P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) und P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
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