Bestämning av basala energiförbrukning och kapaciteten hos termogena adipocyter att förbruka energi hos feta möss
Summary
Detta manuskript beskriver ett protokoll för att mäta den basala ämnesomsättningen och den oxidativa kapaciteten hos termogena adipocyter hos överviktiga möss.
Abstract
Energiförbrukningsmätningar är nödvändiga för att förstå hur förändringar i ämnesomsättningen kan leda till fetma. Basal energiförbrukning kan bestämmas hos möss genom att mäta hela kroppens syreförbrukning, CO2-produktion och fysisk aktivitet med hjälp av metaboliska burar. Termogena bruna/beige adipocyter (BA) bidrar avsevärt till gnagar energiförbrukning, särskilt vid låga omgivningstemperaturer. Här beskrivs mätningar av basala energiförbrukning och total BA-kapacitet att förbruka energi hos feta möss i två detaljerade protokoll: den första förklarar hur man ställer in analysen för att mäta basala energiförbrukning med hjälp av analys av kovarians (ANCOVA), en nödvändig analys med tanke på att energiförbrukningen varierar med kroppsmassan. Det andra protokollet beskriver hur man mäter BA:s energiförbrukningskapacitet in vivo hos möss. Detta förfarande innebär anestesi, som behövs för att begränsa utgifter orsakade av fysisk aktivitet, följt av injektion av beta3-adrenergat agonist, CL-316,243, som aktiverar energiförbrukningen i BA. Dessa två protokoll och deras begränsningar beskrivs tillräckligt detaljerat för att möjliggöra ett lyckat första experiment.
Introduction
Metabolism kan definieras som integrering av de biokemiska reaktioner som är ansvariga för näringsupptag, lagring, omvandling och nedbrytning som celler använder för att växa och utföra sina funktioner. Metaboliska reaktioner omvandlar energin i näringsämnen till en form som kan användas av celler för att syntetisera nya molekyler och utföra arbete. Dessa biokemiska reaktioner är i sig ineffektiva när det gäller att omvandla denna energi till en användbar form för att upprätthålla livet1. Sådan ineffektivitet resulterar i energiavledning i form av värme, där denna värmeproduktion används för att kvantifiera en organisms standardmetabolism (SMR) . Standardtillståndet definierades klassiskt som värmeproduktion som förekommer i en vaken men vilande vuxen, inte intag eller smältning av mat, vid termoneutralitet och utan stress1. Basala ämnesomsättningen (BMR) eller basala energiförbrukning hos möss kallas SMR men hos individer som intar och smälter mat under mild termisk stress (omgivningstemperaturer 21-22 °C)1. Utmaningarna och svårigheterna med att direkt mäta värmeproduktionen gjorde att indirekt kalorimetri, nämligen beräkning av värmeproduktion från syreförbrukningsmätningar, blev det mest populära tillvägagångssättet för att bestämma BMR. Beräkning av BMR från syreförbrukning är möjlig eftersom oxidation av näringsämnen av mitokondrier för att syntetisera ATP är ansvarig för 72% av det totala syre som konsumeras i en organism, med 8% av den totala syreförbrukningen som också förekommer i mitokondrier men utan att generera ATP (uncoupled andning)1. Majoriteten av de återstående 20% av syre som konsumeras kan hänföras till näringsoxidation på andra subcellulära platser (peroxisomal fettsyra oxidation), anabola processer, och reaktiva syre arter bildas1. År 1907 etablerade Lusk således en ekvation, baserad på empiriska mätningar, som ofta används för att omvandla syreförbrukning och CO2-produktion till energiavledning som värme. Hos människor står hjärnan för ~ 25% av BMR, muskuloskeletala systemet för ~ 18,4%, levern för ~ 20 %, hjärtat för ~ 10% och fettvävnaden för ~ 3-7%2. Hos möss är vävnadsbidraget till BMR något annorlunda, med hjärnan som representerar ~ 6,5%, skelettmuskeln ~ 13%, levern ~ 52%, hjärtat ~ 3,7% och fettvävnad ~ 5%3.
Anmärkningsvärt nog är de biokemiska reaktionerna som definierar BMR inte fasta och förändras som svar på olika behov, såsom externt arbete (fysisk aktivitet), utveckling (vävnadstillväxt), inre påfrestningar (motverka infektioner, skador, vävnadsomsättning) och förändringar i omgivningstemperaturen (kallt försvar)1. Vissa organismer rekryterar aktivt processer för att generera värme i kall exponering, vilket innebär att värme som produceras av ämnesomsättningen inte bara är en oavsiktlig biprodukt. Istället valde evolutionen regleringsmekanismer som specifikt kunde uppreglera värmeproduktionen genom att ändra hastigheten på metaboliska reaktioner1. Således kan samma syreförbrukningsmätningar användas för att bestämma en organisms förmåga att generera värme som svar på kyla.
Två stora processer bidrar till värmegenerering vid kall exponering. Den första är skakningar, vilket genererar värme genom att öka mitokondriell oxidativ fosforylering och glykolys i muskler för att täcka det fysiska arbetet som utförs av ofrivillig muskelkontraktion. Därför kommer kall exponering att öka syreförbrukningen i musklerna1. Den andra är Non-Shivering Thermogenesis, som sker genom en ökning av syreförbrukningen i bruna och beige adipocyter (BA). Avledning av energi till värme i BA medieras av mitokondriellt frikopplingsprotein 1 (UCP1), vilket gör det möjligt att komma in i mitokondriell matris igen, vilket minskar mitokondriell protongradient. Avledning av den mitokondriella protongradienten av UCP1 ökar värmeproduktionen genom höjningen av elektronöverföring och syreförbrukning och den energi som frigörs genom protonavledning i sig utan att generera ATP (frikopplad). Dessutom kan termogen BA rekrytera ytterligare mekanismer som höjer syreförbrukningen utan att orsaka en stor upplösning i protongradienten, genom att aktivera fruktil oxidativ ATP-syntes och konsumtionscykler. De metaboliska burar som beskrivs här, nämligen CLAMS-Oxymax-systemet från Columbus Instruments, erbjuder möjligheten att mäta energiförbrukningen vid olika omgivningstemperaturer. Men för att bestämma BA termogen kapacitet med hjälp av mätningar av hela kroppens syreförbrukning måste man: (1) eliminera bidraget från frossa och andra icke-BA-metaboliska processer till energiförbrukning och (2) specifikt aktivera BA termogen aktivitet in vivo. Således beskriver ett andra protokoll hur man selektivt aktiverar BA in vivo med farmakologi hos sövda möss vid termoneutralitet (30 °C), med anestesi och termoneutralitet som begränsar andra icke-BA termogena processer (dvs. fysisk aktivitet). Den farmakologiska strategin för att aktivera BA är att behandla möss med β3-adrenerga receptoragonisten CL-316 246. Anledningen är att kall exponering främjar ett sympatiskt svar som frigör noradrenalin för att aktivera β-adrenergiska receptorer i BA, som aktiverar UCP1 och fettoxidation. Dessutom är β3-adrenerga receptoruttryck mycket berikat i fettvävnad hos möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indirekt kalorimetri har använts i åratal för att bedöma hela kroppens energiförbrukning4. Detta protokoll beskrivs häri ger en enkel metod för att mäta den basala ämnesomsättningen och bestämma BA termogen kapacitet in vivo med hjälp av metaboliska burar.
Den indirekta kalorimetrimetoden som beskrivs här bekräftar att uppdelning av energiförbrukningsvärden efter kroppsviktsvärden kan vara vilseledande. Till exempel kan man dra slutsatsen att e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML finansieras av institutionen för medicin vid UCLA, pilotbidrag från P30 DK 41301 (UCLA:DDRC NIH) och P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
- Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159 (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
- Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
- Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
- Assali, E. A., et al. NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue. Nature Communication. 11 (1), 3347 (2020).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).
- Schena, G., Caplan, M. J. Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask). Cells. 8 (4), 357 (2019).
- Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).
- Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958 (2017).
