Generering og udvidelse af primære, maligne pleurale mesotheliom tumorlinjer

Summary

Målet med dette metodepapir er at demonstrere en robust og reproducerbar metode til berigelse, generering og udvidelse af primære tumorcellelinjer fra kirurgisk resekteret pleural mesotheliom.

Abstract

Nuværende metoder til udvidelse af primære tumorcellelinjer fra sjældne tumortyper mangler. Denne protokol beskriver metoder til at udvide primære tumorceller fra kirurgisk resekteret, malignt pleural mesotheliom (MPM) ved at give et komplet overblik over processen fra fordøjelse til berigelse, ekspansion, kryopræservering og fænotypisk karakterisering. Derudover introducerer denne protokol begreber til tumorgenerering, der kan være nyttige til flere tumortyper, såsom differentiel trypsinisering og virkningen af dissociationsmetoder på påvisning af celleoverflademarkører til fænotypisk karakterisering. Den største begrænsning af denne undersøgelse er udvælgelsen af tumorceller, der vil udvide sig i et todimensionelt (2D) kultursystem. Variationer til denne protokol, herunder tredimensionelle (3D) kultursystemer, medietilskud, pladebelægning for at forbedre vedhæftningen og alternative disaggregeringsmetoder, kunne forbedre denne teknik og den samlede succesrate for etablering af en tumorlinje. Samlet set giver denne protokol en basismetode til etablering og karakterisering af tumorceller fra denne sjældne tumor.

Introduction

Malign pleural mesotheliom (MPM) er en sjælden tumor, der er stærkt forbundet med asbesteksponering. Selvom immunterapibaserede tilgange har vist opmuntrende resultater, er der en mangel på behandlingsmuligheder til rådighed for patienter, der udvikler denne sygdom, og den samlede 5-årige overlevelsesrate er lav ^1,2. Der arbejdes på flere institutioner for bedre at forstå denne sygdom og identificere nye terapeutiske mål, der kan forbedre patientresultaterne. Mens der er flere mesotheliom musemodeller, er adgangen til primære mesotheliom tumorceller mere begrænset³. In vitro-udvidelse af primære mesotheliom tumorceller ville give et værdifuldt modelsystem, der kan bruges til at studere tumorceller direkte og deres interaktion med autologe immunceller såsom tumorinfiltrerende lymfocytter. Mens der har været rapporter om udvidelsen af primære mesotheliom tumorceller linjer, disse er få og giver ikke en detaljeret standard operation procedure (SOP). Desuden er få cellelinjer tilgængelige fra kommercielle kilder såsom American Type Culture Collection (ATCC). Mens tilgængeligheden af primære tumorlinjer er begrænset, er det blevet påvist, at tumorceller kan udvides fra pleurale effusioner og direkte fra tumorvævet ^4,5. Derudover har udvidede tumorcellelinjer vist sig at bevare molekylprofilen af den oprindelige tumor ^4,5,6.

Vores laboratorium studerer tumorimmunmikromiljøet i MPM og har udviklet en metode til udvidelse af primære MPM-tumorcellelinjer fra kirurgisk resekterede tilfælde. Denne metode er tilpasset fra vores erfaring med at etablere primære metastatiske melanom tumorcellelinjer. Målet med dette arbejde er at give en detaljeret, praktisk tilgang til primær mesotheliom tumorlinjeudvidelse ved hjælp af et 2D-modelsystem og efterfølgende fænotypisk profilering. I betragtning af den nylige succes med checkpointblokadestrategier rettet mod CTLA4 og PD-1 i førstelinjeindstillingen², kan evnen til at generere mange primære tumorlinjer fremme forståelsen af begge tumorinsistensektionsmekanismer samt give et vigtigt modelsystem til vurdering af T-cellegenkendelse og dermed uddybe vores forståelse af immunresponset i MPM.

Den største begrænsning af denne protokol er, at hver tumor indeholder et andet mikromiljø, og der er en høj grad af variation i ekspansionssucces. Derudover vælger denne metode for tumorceller, der kan ekspandere i et 2D-kultursystem. Andre metoder, der involverer produktion af en 3D-sfæroid- eller organoidkultur, kan give en alternativ tilgang, der kan give mulighed for en højere succesrate for ekspansion eller resultere i evnen til at udlede cellelinjer, der ikke er i stand til at ekspandere i et traditionelt 2D-system. Sådanne 3D-kulturer har vist sig at være nyttige til generering af tumortyper, der er vanskelige at udvide, for eksempel kræft i bugspytkirtlen⁷.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institution Review Board (IRB) ved University of Texas MD Anderson Cancer Center. Dette vedrører standard-of-care, kirurgisk resekteret MPM tumorer fjernet efter informeret samtykke. 1. Fremstilling af tumorfordøjelsesmedier og andre tilknyttede medier For at forberede tumorfordøjelsesmedier tilsættes 5 ml 100% Pen / Strep (Penicillin / Streptomycin) til 500 ml steril Roswell Park Memorial Institute (RPMI)…

Representative Results

For at bestemme fibroblastforurening af tidlige passagekulturer vurderes celler ved hjælp af et omvendt fasemikroskop for at identificere hyppigheden af fibroblaster i forhold til de andre tilstedeværende klæbende celler. Figur 1 viser eksempler på stigende fibroblastforurening på 80% (figur 1A), 50% (figur 1B) og 30% (figur 1C) sammenlignet med en kultur uden fibroblastforurening (<strong class="x…

Discussion

Selvom denne protokol er ligetil, er der et par kritiske trin, der skal følges nøje. Den tidlige passagefrysning er vigtig for at bevare evnen til at gentage tumorcelleberigelsesprocessen, hvis den oprindeligt ikke lykkes. Evnen til at vurdere fibroblastisk forurening med øjet for at bestemme den korrekte opdelings- og mediesulteteknik er afgørende for at forhindre fibroblastovervækst i kulturen. Derudover kræver den differentielle trypsiniseringsmetode omhyggelig observation af cellerne under inkubation. Cellerne …

Materials

10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML