Генерация и расширение первичных, злокачественных опухолевых линий мезотелиомы плевры
Summary
Целью данного метода является демонстрация надежной и воспроизводимой методологии обогащения, генерации и расширения первичных линий опухолевых клеток из хирургически резецированной мезотелиомы плевры.
Abstract
Современные методологии расширения линий первичных опухолевых клеток из редких типов опухолей отсутствуют. Этот протокол описывает методы расширения первичных опухолевых клеток из хирургически резецированной злокачественной мезотелиомы плевры (MPM), предоставляя полный обзор процесса от пищеварения до обогащения, расширения, криоконсервации и фенотипической характеристики. Кроме того, этот протокол вводит концепции для генерации опухолей, которые могут быть полезны для нескольких типов опухолей, таких как дифференциальная трипсинизация и влияние методов диссоциации на обнаружение маркеров клеточной поверхности для фенотипической характеристики. Основным ограничением этого исследования является отбор опухолевых клеток, которые будут расширяться в двумерной (2D) системе культур. Вариации этого протокола, включая трехмерные (3D) системы культивирования, добавки для среды, покрытие пластин для улучшения адгезии и альтернативные методы дезагрегирования, могут улучшить этот метод и общий показатель успеха создания опухолевой линии. В целом, этот протокол обеспечивает базовый метод для установления и характеристики опухолевых клеток из этой редкой опухоли.
Introduction
Злокачественная мезотелиома плевры (МПМ) является редкой опухолью, тесно связанной с воздействием асбеста. Хотя подходы, основанные на иммунотерапии, показали обнадеживающие результаты, существует нехватка вариантов лечения, доступных для пациентов, у которых развивается это заболевание, а общая 5-летняя выживаемость составляет 1,2. В настоящее время в нескольких учреждениях предпринимаются усилия по лучшему пониманию этого заболевания и выявлению новых терапевтических целей, которые могут улучшить результаты лечения пациентов. Хотя существует несколько моделей мезотелиомы мыши, доступ к первичным опухолевым клеткам мезотелиомы более ограничен3. Расширение in vitro опухолевых клеток первичной мезотелиомы обеспечит ценную модельную систему, которая может быть использована для непосредственного изучения опухолевых клеток и их взаимодействия с аутологичными иммунными клетками, такими как инфильтрирующие опухоль лимфоциты. Хотя были сообщения о расширении линий первичных опухолевых клеток мезотелиомы, они немногочисленны и не предоставляют подробной стандартной процедуры операции (SOP). Кроме того, несколько клеточных линий доступны из коммерческих источников, таких как American Type Culture Collection (ATCC). Хотя доступность первичных опухолевых линий ограничена, было продемонстрировано, что опухолевые клетки могут быть расширены из плевральных выпотов и непосредственно из опухолевой ткани 4,5. Кроме того, было показано, что расширенные линии опухолевых клеток сохраняют молекулярный профиль исходной опухоли 4,5,6.
Наша лаборатория изучает опухоле-иммунную микросреду MPM и разработала метод расширения линий первичных опухолевых клеток MPM из хирургически резецированных случаев. Этот метод адаптирован из нашего опыта в установлении первичных метастатических меланомных опухолевых клеточных линий. Целью данной работы является предоставление подробного, практического подхода к расширению линии первичной опухоли мезотелиомы с использованием системы 2D-моделей и последующего фенотипического профилирования. Учитывая недавний успех стратегий блокады контрольных точек, нацеленных на CTLA4 и PD-1 в условиях первой линии2, способность генерировать множество первичных опухолевых линий может способствовать пониманию обоих внутренних механизмов резистентности опухоли, а также обеспечить важную модельную систему для оценки распознавания Т-клеток, тем самым углубляя наше понимание иммунного ответа в MPM.
Основным ограничением этого протокола является то, что каждая опухоль содержит различную микросреду, и существует высокая степень вариабельности успеха расширения. Кроме того, этот метод подбирает для опухолевых клеток, которые могут расширяться в системе 2D-культуры. Другие методы, которые включают производство 3D-сфероида или органоидной культуры, могут обеспечить альтернативный подход, который может обеспечить более высокую скорость успеха расширения или привести к способности выводить клеточные линии, которые не могут расширяться в традиционной 2D-системе. Было продемонстрировано, что такие 3D-культуры полезны для генерации типов опухолей, которые трудно расширить, например, рака поджелудочной железы7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя этот протокол прост, есть несколько критических шагов, которые необходимо тщательно соблюдать. Замораживание раннего прохождения важно для сохранения способности повторять процесс обогащения опухолевых клеток, если изначально безуспешный. Способность оценивать фибробластное ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Ракель Лаза-Бривьеска за ее вклад в запуск этого протокола, а также докторов Бориса Сепеси, Резу Мехран и Дэвида Райса за сотрудничество в области коллекций тканей. Никакого дополнительного финансирования, связанного с этой работой, нет.
Materials
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A. Preclinical models of malignant mesothelioma. Frontiers in Oncology. 10, 101 (2020).
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
