Generatie en uitbreiding van primaire, maligne pleurale mesothelioomtumorlijnen
Summary
Het doel van deze methodepaper is om een robuuste en reproduceerbare methodologie te demonstreren voor de verrijking, generatie en uitbreiding van primaire tumorcellijnen uit chirurgisch gereseceerd pleuraal mesothelioom.
Abstract
De huidige methodologieën voor de uitbreiding van primaire tumorcellijnen van zeldzame tumortypen ontbreken. Dit protocol beschrijft methoden om primaire tumorcellen uit te breiden van chirurgisch gereseceerd, maligne pleuraal mesothelioom (MPM) door een volledig overzicht te geven van het proces van spijsvertering tot verrijking, expansie, cryopreservatie en fenotypische karakterisering. Daarnaast introduceert dit protocol concepten voor tumorgeneratie die nuttig kunnen zijn voor meerdere tumortypen, zoals differentiële trypsinisatie en de impact van dissociatiemethoden op de detectie van celoppervlakmarkers voor fenotypische karakterisering. De belangrijkste beperking van deze studie is de selectie van tumorcellen die zich zullen uitbreiden in een tweedimensionaal (2D) kweeksysteem. Variaties op dit protocol, waaronder driedimensionale (3D) kweeksystemen, mediasupplementen, plaatcoating om de hechting te verbeteren en alternatieve desaggregatiemethoden, kunnen deze techniek en het algehele succespercentage van het vaststellen van een tumorlijn verbeteren. Over het algemeen biedt dit protocol een basismethode voor het vaststellen en karakteriseren van tumorcellen van deze zeldzame tumor.
Introduction
Maligne pleuraal mesothelioom (MPM) is een zeldzame tumor die sterk geassocieerd is met blootstelling aan asbest. Hoewel op immunotherapie gebaseerde benaderingen bemoedigende resultaten hebben laten zien, is er een tekort aan behandelingsopties beschikbaar voor patiënten die deze ziekte ontwikkelen, en de totale 5-jaarsoverleving is laag 1,2. Er zijn inspanningen aan de gang bij meerdere instellingen om deze ziekte beter te begrijpen en nieuwe therapeutische doelen te identificeren die de resultaten voor patiënten kunnen verbeteren. Hoewel er meerdere mesothelioom muismodellen zijn, is de toegang tot primaire mesothelioomtumorcellen beperkter3. In vitro expansie van primaire mesothelioom tumorcellen zou een waardevol modelsysteem bieden dat kan worden gebruikt om tumorcellen rechtstreeks te bestuderen en hun interactie met autologe immuuncellen zoals tumor-infiltrerende lymfocyten. Hoewel er rapporten zijn geweest over de uitbreiding van primaire mesothelioom tumorcellijnen, zijn dit er maar weinig en bieden ze geen gedetailleerde standaardoperatieprocedure (SOP). Bovendien zijn er weinig cellijnen beschikbaar uit commerciële bronnen zoals American Type Culture Collection (ATCC). Hoewel de beschikbaarheid van primaire tumorlijnen beperkt is, is aangetoond dat tumorcellen kunnen worden uitgebreid van pleurale effusies en rechtstreeks van het tumorweefsel 4,5. Bovendien is aangetoond dat uitgebreide tumorcellijnen het moleculaire profiel van de oorspronkelijke tumor behouden 4,5,6.
Ons laboratorium bestudeert de tumor-immuun micro-omgeving van MPM en heeft een methode ontwikkeld voor het uitbreiden van primaire MPM-tumorcellijnen uit chirurgisch gereseceerde gevallen. Deze methode is gebaseerd op onze ervaring met het vaststellen van primaire gemetastaseerde melanoomtumorcellijnen. Het doel van dit werk is om een gedetailleerde, praktische benadering te bieden voor de uitbreiding van primaire mesothelioomtumorlijnen met behulp van een 2D-modelsysteem en daaropvolgende fenotypische profilering. Gezien het recente succes van checkpointblokkadestrategieën gericht op CTLA4 en PD-1 in de eerstelijnssetting2, zou het vermogen om veel primaire tumorlijnen te genereren het begrip van zowel tumorintrinsieke mechanismen van resistentie kunnen bevorderen als een belangrijk modelsysteem kunnen bieden om T-celherkenning te beoordelen, waardoor ons begrip van de immuunrespons in MPM wordt verdiept.
De belangrijkste beperking van dit protocol is dat elke tumor een andere micro-omgeving bevat en dat er een hoge mate van variabiliteit van expansiesucces is. Daarnaast selecteert deze methode voor tumorcellen die kunnen uitzetten in een 2D-kweeksysteem. Andere methoden waarbij een 3D-sferoïde of organoïde cultuur wordt geproduceerd, kunnen een alternatieve benadering bieden die een hoger slagingspercentage van expansie mogelijk maakt of resulteert in het vermogen om cellijnen af te leiden die niet in staat zijn om uit te breiden in een traditioneel 2D-systeem. Van dergelijke 3D-culturen is aangetoond dat ze nuttig zijn voor het genereren van tumortypen die moeilijk uit te breiden zijn, bijvoorbeeld alvleesklierkanker7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel dit protocol eenvoudig is, zijn er een paar kritieke stappen die nauwlettend moeten worden gevolgd. De vroege passagebevriezing is belangrijk om het vermogen te behouden om het tumorcelverrijkingsproces te herhalen als het aanvankelijk niet succesvol is. Het vermogen om fibroblastische besmetting met het oog te beoordelen om de juiste splitsings- en media-uithongeringstechniek te bepalen, is van vitaal belang om fibroblastovergroei in de cultuur te voorkomen. Bovendien vereist de differentiële trypsinisatiemethod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Raquel Laza-Briviesca bedanken voor haar bijdrage aan het starten van dit protocol en Drs. Boris Sepesi, Reza Mehran en David Rice voor de samenwerking op het gebied van weefselcollecties. Er is geen extra financiering verbonden aan dit werk.
Materials
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A. Preclinical models of malignant mesothelioma. Frontiers in Oncology. 10, 101 (2020).
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
