原発性悪性胸膜中皮腫腫瘍ラインの生成と拡張
Summary
この方法論文の目標は、外科的に切除された胸膜中皮腫からの原発性腫瘍細胞株の濃縮、生成、および拡大のための堅牢で再現可能な方法論を実証することである。
Abstract
希少腫瘍型からの原発性腫瘍細胞株の拡大のための現在の方法論は欠けている。このプロトコルは、消化から濃縮、拡大、凍結保存、および表現型特性評価までのプロセスの完全な概要を提供することにより、外科的に切除された悪性胸膜中皮腫(MPM)から原発性腫瘍細胞を拡大する方法を記載している。さらに、このプロトコルは、示差的トリプシン処理や、表現型特徴付けのための細胞表面マーカーの検出に対する解離法の影響など、複数の腫瘍型に有用であり得る腫瘍生成の概念を導入する。この研究の主な限界は、2次元(2D)培養系で拡大する腫瘍細胞の選択である。3次元(3D)培養システム、培地サプリメント、接着性を改善するためのプレートコーティング、および代替の脱凝集法を含むこのプロトコルのバリエーションは、この技術および腫瘍ラインの確立の全体的な成功率を改善する可能性がある。全体として、このプロトコルは、この希少な腫瘍からの腫瘍細胞を樹立および特徴付けるための基本方法を提供する。
Introduction
悪性胸膜中皮腫(MPM)は、アスベスト曝露と高度に関連するまれな腫瘍である。免疫療法に基づくアプローチは有望な結果を示しているが、この疾患を発症する患者が利用できる治療選択肢は乏しく、5年生存率は低い1,2。この疾患をよりよく理解し、患者の転帰を改善する可能性のある新しい治療標的を特定するための努力が複数の施設で進行中である。複数の中皮腫マウスモデルが存在するが、原発性中皮腫腫瘍細胞へのアクセスはより限定的である3。原発性中皮腫腫瘍細胞のインビトロ増殖は、腫瘍細胞を直接研究し、腫瘍浸潤リンパ球などの自家免疫細胞との相互作用を研究するために利用できる貴重なモデル系を提供するであろう。原発性中皮腫腫瘍細胞株の拡大に関する報告はあるが、これらはほとんどなく、詳細な標準操作手順(SOP)を提供していない。さらに、American Type Culture Collection(ATCC)などの市販の供給源から入手できる細胞株はほとんどありません。原発性腫瘍株の利用可能性は限られているが、腫瘍細胞は胸水から、そして腫瘍組織から直接拡張され得ることが実証されている4,5。加えて、拡張腫瘍細胞株は、元の腫瘍の分子プロフィールを保存することが示されている4、5、6。
当研究室では、MPMの腫瘍免疫微小環境を研究しており、外科的に切除した症例から原発性MPM腫瘍細胞株を拡大する方法を開発しています。この方法は、原発性転移性黒色腫腫瘍細胞株の確立における我々の経験から適応される。この研究の目標は、2Dモデルシステムとその後の表現型プロファイリングを使用して、原発性中皮腫腫瘍ライン拡張に対する詳細で実用的なアプローチを提供することである。第一選択設定2におけるCTLA4およびPD-1を標的とするチェックポイント遮断戦略の最近の成功を考えると、多くの原発性腫瘍線を生成する能力は、腫瘍固有の耐性メカニズムの理解を深めるとともに、T細胞認識を評価するための重要なモデルシステムを提供し、MPMにおける免疫応答の理解を深める可能性がある。
このプロトコルの主な制限は、すべての腫瘍が異なる微小環境を含み、拡張の成功の高度の変動性があることである。さらに、この方法は、2D培養系において増殖し得る腫瘍細胞を選択する。3Dスフェロイドまたはオルガノイド培養物の生産を含む他の方法は、より高い成功率の拡張を可能にするか、または従来の2Dシステムでは拡張できない細胞株を誘導する能力をもたらす代替アプローチを提供する可能性がある。このような3D培養物は、例えば膵臓癌7の拡張が困難な腫瘍型の生成に有用であることが実証されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは簡単ですが、厳密に従わなければならない重要な手順がいくつかあります。早期継代凍結は、最初に成功しなかった場合に腫瘍細胞濃縮プロセスを繰り返す能力を保持するために重要である。正しい分割および培地飢餓技術を決定するために、目で線維芽細胞汚染を評価する能力は、培養中の線維芽細胞の過剰増殖を防ぐために不可欠である。さらに、示差トリプシン法は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルの開始に貢献したRaquel Laza-Briviescaと、組織コレクションに関するコラボレーションのためにBoris Sepesi博士、Reza Mehran博士、David Rice博士に感謝します。この作業に関連する追加の資金はありません。
Materials
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
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