Erzeugung und Erweiterung primärer, maligner pleuraler Mesotheliom-Tumorlinien

Summary

Das Ziel dieser Methodenarbeit ist es, eine robuste und reproduzierbare Methodik für die Anreicherung, Erzeugung und Expansion von primären Tumorzelllinien aus chirurgisch resezierten Pleuramesotheliomen zu demonstrieren.

Abstract

Aktuelle Methoden zur Erweiterung primärer Tumorzelllinien aus seltenen Tumorarten fehlen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Erweiterung primärer Tumorzellen aus chirurgisch reseziertem, malignem Pleuramesotheliom (MPM), indem es einen vollständigen Überblick über den Prozess von der Verdauung bis zur Anreicherung, Expansion, Kryokonservierung und phänotypischen Charakterisierung bietet. Darüber hinaus stellt dieses Protokoll Konzepte für die Tumorgenerierung vor, die für mehrere Tumorarten nützlich sein können, wie z. B. die differentielle Trypsinisierung und den Einfluss von Dissoziationsmethoden auf den Nachweis von Zelloberflächenmarkern für die phänotypische Charakterisierung. Die Haupteinschränkung dieser Studie ist die Auswahl von Tumorzellen, die sich in einem zweidimensionalen (2D) Kultursystem ausdehnen. Variationen dieses Protokolls, einschließlich dreidimensionaler (3D) Kultursysteme, Medienergänzungen, Plattenbeschichtung zur Verbesserung der Haftung und alternativer Disaggregationsmethoden, könnten diese Technik und die Gesamterfolgsrate bei der Etablierung einer Tumorlinie verbessern. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine Basismethode zur Etablierung und Charakterisierung von Tumorzellen aus diesem seltenen Tumor.

Introduction

Das maligne Pleuramesotheliom (MPM) ist ein seltener Tumor, der stark mit Asbestexposition assoziiert ist. Obwohl immuntherapiebasierte Ansätze ermutigende Ergebnisse gezeigt haben, gibt es einen Mangel an Behandlungsmöglichkeiten für Patienten, die diese Krankheit entwickeln, und die Gesamtüberlebensrate von 5 Jahren ist niedrig ^1,2. An mehreren Institutionen werden Anstrengungen unternommen, um diese Krankheit besser zu verstehen und neue therapeutische Ziele zu identifizieren, die die Patientenergebnisse verbessern können. Während es mehrere Mesotheliom-Mausmodelle gibt, ist der Zugang zu primären Mesotheliom-Tumorzellen begrenzter³. Die In-vitro-Expansion primärer Mesotheliom-Tumorzellen würde ein wertvolles Modellsystem liefern, mit dem Tumorzellen und ihre Interaktion mit autologen Immunzellen wie tumorinfiltrierenden Lymphozyten direkt untersucht werden können. Während es Berichte über die Expansion der primären Mesotheliom-Tumorzelllinien gibt, sind diese wenige und bieten keine detaillierte Standard-Operationsmethode (SOP). Darüber hinaus sind nur wenige Zelllinien aus kommerziellen Quellen wie der American Type Culture Collection (ATCC) verfügbar. Während die Verfügbarkeit von primären Tumorlinien begrenzt ist, wurde gezeigt, dass Tumorzellen aus Pleuraergüssen und direkt aus dem Tumorgewebe erweitert werden können ^4,5. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass erweiterte Tumorzelllinien das molekulare Profil des ursprünglichen Tumors ^4,5,6 erhalten.

Unser Labor untersucht die tumorimmune Mikroumgebung von MPM und hat eine Methode zur Erweiterung primärer MPM-Tumorzelllinien aus chirurgisch resezierten Fällen entwickelt. Diese Methode basiert auf unseren Erfahrungen bei der Etablierung primärer metastasierender Melanom-Tumorzelllinien. Ziel dieser Arbeit ist es, einen detaillierten, praktischen Ansatz für die Erweiterung der primären Mesotheliom-Tumorlinie unter Verwendung eines 2D-Modellsystems und anschließender phänotypischer Profilierung zu bieten. Angesichts des jüngsten Erfolgs von Checkpoint-Blockadestrategien, die auf CTLA4 und PD-1 in der Erstlinieneinstellung^{abzielen 2}, könnte die Fähigkeit, viele primäre Tumorlinien zu erzeugen, das Verständnis sowohl der intrinsischen Resistenzmechanismen des Tumors fördern als auch ein wichtiges Modellsystem zur Beurteilung der T-Zell-Erkennung bereitstellen und so unser Verständnis der Immunantwort bei MPM vertiefen.

Die Haupteinschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass jeder Tumor eine andere Mikroumgebung enthält und ein hohes Maß an Variabilität des Expansionserfolgs besteht. Darüber hinaus selektiert diese Methode nach Tumorzellen, die sich in einem 2D-Kultursystem ausdehnen können. Andere Methoden, die die Herstellung einer 3D-Sphäroid- oder Organoidkultur beinhalten, könnten einen alternativen Ansatz bieten, der eine höhere Erfolgsrate der Expansion ermöglichen oder dazu führen kann, dass Zelllinien abgeleitet werden können, die sich in einem traditionellen 2D-System nicht ausdehnen können. Solche 3D-Kulturen haben sich als nützlich für die Erzeugung von Tumorarten erwiesen, die schwer zu erweitern sind, zum Beispiel Bauchspeicheldrüsenkrebs⁷.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institution Review Board (IRB) des MD Anderson Cancer Center der University of Texas genehmigt. Dies betrifft Standard-of-Care, chirurgisch resezierte MPM-Tumoren, die nach Einverständniserklärung entfernt wurden. 1. Aufbereitung von Tumorverdauungsmedien und anderen zugehörigen Medien Um Tumorverdauungsmedien vorzubereiten, fügen Sie 5 ml 100% Pen / Streptokokken (Penicillin / Streptomycin) zu 500 ml sterilem Roswell P…

Representative Results

Um die Fibroblastenkontamination von frühen Passagekulturen zu bestimmen, werden Zellen mit einem Inverted-Phase-Mikroskop bewertet, um die Häufigkeit von Fibroblasten im Verhältnis zu den anderen vorhandenen adhärenten Zellen zu identifizieren. Abbildung 1 zeigt Beispiele für eine zunehmende Fibroblastenkontamination von 80% (Abbildung 1A), 50% (Abbildung 1B) und 30% (Abbildung 1C) im Vergleich zu einer Kultur ohne Fibroblastenkontamination (<strong class=…

Discussion

Während dieses Protokoll einfach ist, gibt es ein paar kritische Schritte, die genau befolgt werden müssen. Das Einfrieren der frühen Passage ist wichtig, um die Fähigkeit zu erhalten, den Tumorzellanreicherungsprozess zu wiederholen, wenn er zunächst nicht erfolgreich ist. Die Fähigkeit, die fibroblastische Kontamination mit dem Auge zu beurteilen, um die richtige Spaltungs- und Medienhungertechnik zu bestimmen, ist entscheidend für die Verhinderung von Fibroblastenüberwucherung in der Kultur. Darüber hinaus er…

Materials

10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML