Geração e Expansão das Linhas tumorais primárias e malignas do mesotelioma

Summary

O objetivo deste artigo método é demonstrar uma metodologia robusta e reprodutível para o enriquecimento, geração e expansão das linhas celulares tumorais primárias a partir de mesotelioma pleural ressecado cirurgicamente.

Abstract

As metodologias atuais para a expansão das linhas primárias de células tumorais de tipos raros de tumores estão em falta. Este protocolo descreve métodos para expandir as células tumorais primárias a partir de mesotelioma pleural ressecado cirurgicamente e maligno (MPM), fornecendo uma visão geral completa do processo desde a digestão até o enriquecimento, expansão, criopreservação e caracterização fenotípica. Além disso, este protocolo introduz conceitos para a geração de tumores que podem ser úteis para vários tipos de tumores, como a trippsinização diferencial e o impacto dos métodos de dissociação na detecção de marcadores de superfície celular para caracterização fenotípica. A maior limitação deste estudo é a seleção de células tumorais que se expandirão em um sistema de cultura bidimensional (2D). Variações neste protocolo, incluindo sistemas de cultura tridimensional (3D), suplementos de mídia, revestimento de placas para melhorar a adesão e métodos alternativos de desagregação, poderiam melhorar essa técnica e a taxa de sucesso geral do estabelecimento de uma linha de tumor. No geral, este protocolo fornece um método base para estabelecer e caracterizar células tumorais a partir deste tumor raro.

Introduction

O mesotelioma pleural maligno (MPM) é um tumor raro altamente associado à exposição ao amianto. Embora as abordagens baseadas em imunoterapia tenham mostrado resultados encorajadores, há uma escassez de opções de tratamento disponíveis para os pacientes que desenvolvem essa doença, e a taxa geral de sobrevivência de 5 anos é baixa^{de 1,2}. Esforços estão em andamento em várias instituições para entender melhor essa doença e identificar novos alvos terapêuticos que possam melhorar os resultados dos pacientes. Embora existam vários modelos de camundongos de mesotelioma, o acesso às células tumorais primárias do mesotelioma é mais limitado³. A expansão in vitro das células tumorais primárias do mesotelioma forneceria um valioso sistema modelo que pode ser utilizado para estudar diretamente as células tumorais e sua interação com células imunes autólogas, como linfócitos infiltrados em tumores. Embora tenha havido relatos sobre a expansão das linhas primárias de células tumorais de mesotelioma, estas são poucas e não fornecem um procedimento padrão de operação (SOP) detalhado. Além disso, poucas linhas de celular estão disponíveis a partir de fontes comerciais, como a American Type Culture Collection (ATCC). Embora a disponibilidade de linhas tumorais primárias seja limitada, foi demonstrado que as células tumorais podem ser expandidas a partir de derrames pleurais e diretamente do tecido tumoral ^4,5. Além disso, linhas de células tumorais expandidas têm sido demonstradas para preservar o perfil molecular do tumor original ^4,5,6.

Nosso laboratório está estudando o microambiente tumor-imune do MPM e desenvolveu um método para expandir as linhas primárias de células tumorais mpm a partir de casos ressecados cirurgicamente. Este método é adaptado de nossa experiência no estabelecimento de linhas celulares tumorais de melanoma metastático primário. O objetivo deste trabalho é fornecer uma abordagem detalhada e prática para a expansão da linha de tumores mesotelioma primário usando um sistema modelo 2D e perfil fenotípico subsequente. Dado o sucesso recente das estratégias de bloqueio de checkpoint visando CTLA4 e PD-1 na configuração de primeira linha², a capacidade de gerar muitas linhas tumorais primárias poderia promover a compreensão de ambos os mecanismos intrínsecos de resistência tumorais, bem como fornecer um importante sistema de modelo para avaliar o reconhecimento de células T, aprofundando assim nossa compreensão da resposta imune no MPM.

A maior limitação deste protocolo é que cada tumor contém um microambiente diferente, e há um alto grau de variabilidade do sucesso de expansão. Além disso, este método seleciona para células tumorais que podem se expandir em um sistema de cultura 2D. Outros métodos que envolvem a produção de uma cultura esferoide ou organoide 3D poderiam fornecer uma abordagem alternativa que pode permitir uma maior taxa de sucesso de expansão ou resultar na capacidade de derivar linhas celulares que são incapazes de se expandir em um sistema 2D tradicional. Tais culturas 3D têm sido demonstradas como úteis para a geração de tipos de tumores que são difíceis de expandir, por exemplo, o câncer de pâncreas⁷.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Institution Review Board (IRB) do Centro de Câncer Anderson da Universidade do Texas MD Anderson. Isso diz respeito aos tumores mpm ressecção cirúrgica e padrão removidos após o consentimento informado. 1. Preparação de mídia de digestão de tumores e outras mídias associadas Para preparar a mídia de digestão tumoral, adicione 5 mL de 100% Pen/Strep (Penicillin/Streptomycin) a 500 mL de estéril Roswel…

Representative Results

Para determinar a contaminação do fibroblasto das culturas de passagem precoce, as células são avaliadas usando um microscópio de fase invertida para identificar a frequência de fibroblastos em relação às outras células aderentes presentes. A Figura 1 mostra exemplos de aumento da contaminação do fibroblasto de 80% (Figura 1A), 50% (Figura 1B) e 30% (Figura 1C), em comparação com uma cultu…

Discussion

Embora este protocolo seja simples, existem alguns passos críticos que devem ser seguidos de perto. O congelamento da passagem precoce é importante para preservar a capacidade de repetir o processo de enriquecimento tumoral-células, se inicialmente mal sucedido. A capacidade de avaliar a contaminação fibroblástica pelo olho para decidir a técnica correta de divisão e fome da mídia é vital para evitar o crescimento excessivo do fibroblasto na cultura. Além disso, o método diferencial de trippsinização requer…

Materials

10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML