원발성, 악성 흉막 중피종 종양 라인의 생성 및 확장

Summary

이 방법 논문의 목표는 외과적으로 절제된 흉막 중피종으로부터 원발성 종양 세포주의 농축, 생성 및 확장을 위한 강력하고 재현 가능한 방법론을 입증하는 것이다.

Abstract

희귀 종양 유형으로부터 원발성 종양 세포주의 확장을 위한 현재의 방법론은 결여되어 있다. 이 프로토콜은 소화에서 농축, 확장, 냉동 보존 및 표현형 특성화에 이르는 과정에 대한 완전한 개요를 제공함으로써 외과적으로 절제된 악성 흉막 중피종(MPM)으로부터 원발성 종양 세포를 확장하는 방법을 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 차등 트립신화와 같은 다수의 종양 유형에 유용할 수 있는 종양 생성에 대한 개념을 소개하고, 표현형 특성화를 위한 세포 표면 마커의 검출에 대한 해리 방법의 영향을 소개한다. 이 연구의 주요 한계는 2차원(2D) 배양 시스템에서 확장될 종양 세포의 선택이다. 3차원(3D) 배양 시스템, 배지 보충제, 부착을 개선하기 위한 플레이트 코팅, 및 대체 분해 방법을 포함하는 이 프로토콜의 변형은 이 기술과 종양 라인 구축의 전반적인 성공률을 향상시킬 수 있다. 전반적으로, 이 프로토콜은 이 희귀 종양으로부터 종양 세포를 확립하고 특성화하기 위한 기본 방법을 제공한다.

Introduction

악성 흉막 중피종 (MPM)은 석면 노출과 매우 관련이있는 드문 종양입니다. 면역 요법 기반 접근법이 고무적인 결과를 보여 주었지만,이 질병을 앓고있는 환자에게 사용할 수있는 치료 옵션이 부족하며 전체 5 년 생존율은 ^1,2로 낮습니다. 이 질병을 더 잘 이해하고 환자 결과를 향상시킬 수있는 새로운 치료 목표를 식별하기위한 여러 기관에서 노력이 진행되고 있습니다. 다수의 중피종 마우스 모델이 존재하지만, 원발성 중피종 종양 세포에 대한 접근은 더욱 제한적이다³. 원발성 중피종 종양 세포의 시험관내 확장은 종양 세포를 직접 연구하는데 활용될 수 있는 유용한 모델 시스템을 제공할 것이며, 종양 침윤 림프구와 같은 자가 면역 세포와의 상호작용을 제공할 것이다. 원발성 중피종 종양 세포주의 확장에 대한 보고가 있었지만, 이들은 거의 없으며 상세한 표준 수술 절차(SOP)를 제공하지 않는다. 또한, ATCC(American Type Culture Collection)와 같은 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있는 세포주는 거의 없다. 원발성 종양 라인의 이용가능성은 제한되어 있지만, 종양 세포가 흉막 삼출액으로부터 그리고 종양 조직으로부터 직접 확장될 수 있다는 것이 입증되었다^(4,5). 또한, 확장된 종양 세포주는 원래의 종양 ^4,5,6의 분자 프로파일을 보존하는 것으로 나타났다.

우리 실험실은 MPM의 종양 면역 미세 환경을 연구하고 있으며 외과 적으로 절제된 사례에서 원발성 MPM 종양 세포주를 확장하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 원발성 전이성 흑색종 종양 세포주를 확립하는 우리의 경험으로부터 적응된다. 이 연구의 목표는 2D 모델 시스템 및 후속 표현형 프로파일링을 사용하여 원발성 중피종 종양 라인 확장에 대한 상세하고 실용적인 접근법을 제공하는 것입니다. 첫 번째 라인 설정²에서 CTLA4 및 PD-1을 표적으로 하는 체크포인트 봉쇄 전략의 최근 성공을 감안할 때, 많은 원발성 종양 라인을 생성하는 능력은 종양 내성의 내재적 메커니즘에 대한 이해를 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 T 세포 인식을 평가하는 중요한 모델 시스템을 제공할 수 있으며, 따라서 MPM에서의 면역 반응에 대한 우리의 이해를 심화시킬 수 있다.

이 프로토콜의 주요 한계는 모든 종양이 다른 미세 환경을 포함하고 확장 성공의 높은 수준의 가변성이 있다는 것입니다. 또한, 이 방법은 2D 배양 시스템에서 확장할 수 있는 종양 세포를 선택한다. 3D 스페로이드 또는 오가노이드 배양의 생산을 수반하는 다른 방법은 더 높은 확장 성공률을 허용하거나 전통적인 2D 시스템에서 확장할 수 없는 세포주를 유도하는 능력을 초래할 수 있는 대안적인 접근법을 제공할 수 있다. 이러한 3D 배양은 확장하기 어려운 종양 유형, 예를 들어 췌장암⁷의 생성에 유용한 것으로 입증되었다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 방법은 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터의 기관 검토위원회 (IRB)의 승인을 받았습니다. 이것은 표준 치료, 외과 적으로 절제된 MPM 종양이 정보에 입각 한 동의에 따라 제거되는 것과 관련이 있습니다. 1. 종양 소화 매질 및 다른 관련 매질의 제조 종양 소화 배지를 준비하려면 층류 후드에 멸균된 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI) 1640 배지 5…

Representative Results

초기 계대 배양의 섬유아세포 오염을 결정하기 위해, 세포는 존재하는 다른 부착성 세포에 비해 섬유아세포의 빈도를 확인하기 위해 반전된 위상 현미경을 사용하여 평가된다. 도 1은 섬유아세포 오염이 없는 배양물에 비해 80%(도 1A), 50%(도 1B) 및 30%(도 1C)의 섬유아세포 오염이 증가한 예를 보여준다(도 1D).<s…

Discussion

이 프로토콜은 간단하지만 면밀히 따라야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 조기 통과 동결은 초기에 실패한 경우 종양-세포 농축 과정을 반복하는 능력을 보존하는 데 중요하다. 정확한 분할 및 배지 기아 기술을 결정하기 위해 눈으로 섬유아세포 오염을 평가하는 능력은 배양물에서 섬유아세포의 과성장을 방지하는 데 매우 중요합니다. 또한, 시차 트립신화 방법은 배양 동안 세포의 신중한 …

Materials

10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML