पीढ़ी और प्राथमिक, घातक फुफ्फुस मेसोथेलियोमा ट्यूमर लाइनों का विस्तार
Summary
इस विधि पत्र का लक्ष्य शल्य चिकित्सा द्वारा विच्छेदित फुफ्फुस मेसोथेलियोमा से प्राथमिक ट्यूमर सेल लाइनों के संवर्धन, पीढ़ी और विस्तार के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पद्धति का प्रदर्शन करना है।
Abstract
दुर्लभ ट्यूमर प्रकारों से प्राथमिक ट्यूमर सेल लाइनों के विस्तार के लिए वर्तमान पद्धतियों की कमी है। यह प्रोटोकॉल पाचन से संवर्धन, विस्तार, क्रायोप्रिजर्वेशन और फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन तक प्रक्रिया का पूरा अवलोकन प्रदान करके शल्य चिकित्सा, घातक फुफ्फुस मेसोथेलियोमा (एमपीएम) से प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं का विस्तार करने के तरीकों का वर्णन करता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल ट्यूमर पीढ़ी के लिए अवधारणाओं का परिचय देता है जो कई ट्यूमर प्रकारों जैसे कि अंतर ट्रिप्सिनाइजेशन और फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन के लिए सेल सतह मार्करों का पता लगाने पर पृथक्करण विधियों के प्रभाव के लिए उपयोगी हो सकता है। इस अध्ययन की प्रमुख सीमा ट्यूमर कोशिकाओं का चयन है जो दो आयामी (2 डी) संस्कृति प्रणाली में विस्तार करेगी। तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों, मीडिया की खुराक, आसंजन में सुधार करने के लिए प्लेट कोटिंग, और वैकल्पिक विघटन विधियों सहित इस प्रोटोकॉल के लिए विविधताएं, इस तकनीक और ट्यूमर लाइन स्थापित करने की समग्र सफलता दर में सुधार कर सकती हैं। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल इस दुर्लभ ट्यूमर से ट्यूमर कोशिकाओं की स्थापना और लक्षण वर्णन के लिए एक आधार विधि प्रदान करता है।
Introduction
घातक फुफ्फुस मेसोथेलियोमा (एमपीएम) एक दुर्लभ ट्यूमर है जो एस्बेस्टस एक्सपोजर से जुड़ा हुआ है। यद्यपि इम्यूनोथेरेपी-आधारित दृष्टिकोणों ने उत्साहजनक परिणाम दिखाए हैं, लेकिन इस बीमारी को विकसित करने वाले रोगियों के लिए उपलब्ध उपचार विकल्पों की कमी है, और समग्र 5 साल की जीवित रहने की दर कम 1,2 है। इस बीमारी को बेहतर ढंग से समझने और उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए कई संस्थानों में प्रयास चल रहे हैं जो रोगी के परिणामों में सुधार कर सकते हैं। जबकि कई मेसोथेलियोमा माउस मॉडल हैं, प्राथमिक मेसोथेलियोमा ट्यूमर कोशिकाओं तक पहुंच अधिक सीमित है3. प्राथमिक मेसोथेलियोमा ट्यूमर कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार में एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली प्रदान की जाएगी जिसका उपयोग ट्यूमर कोशिकाओं का सीधे अध्ययन करने और ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइटों जैसे ऑटोलॉगस प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत के लिए किया जा सकता है। जबकि प्राथमिक मेसोथेलियोमा ट्यूमर कोशिकाओं लाइनों के विस्तार पर रिपोर्टें हैं, ये कुछ हैं और एक विस्तृत मानक संचालन प्रक्रिया (एसओपी) प्रदान नहीं करते हैं। इसके अलावा, कुछ सेल लाइनें वाणिज्यिक स्रोतों जैसे अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी) से उपलब्ध हैं। जबकि प्राथमिक ट्यूमर लाइनों की उपलब्धता सीमित है, यह प्रदर्शित किया गया है कि ट्यूमर कोशिकाओं को फुफ्फुस बहाव से और सीधे ट्यूमर ऊतक 4,5 से विस्तारित किया जा सकता है। इसके अलावा, विस्तारित ट्यूमर सेल लाइनों को मूल ट्यूमर 4,5,6 के आणविक प्रोफ़ाइल को संरक्षित करने के लिए दिखाया गया है।
हमारी प्रयोगशाला एमपीएम के ट्यूमर-प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट का अध्ययन कर रही है और शल्य चिकित्सा के मामलों से प्राथमिक एमपीएम ट्यूमर कोशिकाओं लाइनों का विस्तार करने के लिए एक विधि विकसित की है। यह विधि प्राथमिक मेटास्टैटिक मेलेनोमा ट्यूमर सेल लाइनों की स्थापना में हमारे अनुभव से अनुकूलित है। इस काम का लक्ष्य 2 डी मॉडल सिस्टम और बाद में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग का उपयोग करके प्राथमिक मेसोथेलियोमा ट्यूमर लाइन विस्तार के लिए एक विस्तृत, व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रदान करना है। पहली पंक्ति सेटिंग2 में सीटीएलए 4 और पीडी -1 को लक्षित करने वाली चेकपॉइंट नाकाबंदी रणनीतियों की हालिया सफलता को देखते हुए, कई प्राथमिक ट्यूमर लाइनों को उत्पन्न करने की क्षमता प्रतिरोध के ट्यूमर आंतरिक तंत्र दोनों की समझ को आगे बढ़ा सकती है और साथ ही टी-सेल मान्यता का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली प्रदान कर सकती है, इस प्रकार एमपीएम में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की हमारी समझ को गहरा कर सकती है।
इस प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमा यह है कि प्रत्येक ट्यूमर में एक अलग माइक्रोएन्वायरमेंट होता है, और विस्तार की सफलता की परिवर्तनशीलता की एक उच्च डिग्री होती है। इसके अलावा, यह विधि ट्यूमर कोशिकाओं के लिए चयन करती है जो 2 डी संस्कृति प्रणाली में विस्तार कर सकती हैं। अन्य विधियां जिनमें 3 डी स्फेरॉइड या ऑर्गेनॉइड संस्कृति का उत्पादन शामिल है, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है जो विस्तार की उच्च सफलता दर की अनुमति दे सकता है या परिणामस्वरूप सेल लाइनों को प्राप्त करने की क्षमता हो सकती है जो पारंपरिक 2 डी सिस्टम में विस्तार करने में असमर्थ हैं। इस तरह की 3 डी संस्कृतियों को ट्यूमर प्रकारों की पीढ़ी के लिए उपयोगी होने का प्रदर्शन किया गया है जो विस्तार करना मुश्किल है, उदाहरण के लिए, अग्नाशयी कैंसर7.
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि यह प्रोटोकॉल सीधा है, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिनका बारीकी से पालन किया जाना चाहिए। शुरुआती मार्ग फ्रीज ट्यूमर-सेल संवर्धन प्रक्रिया को दोहराने की क्षमता को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल को शुरू करने में उनके योगदान के लिए राकेल लाजा-ब्रिविस्का और ऊतक संग्रह पर सहयोग के लिए डॉ बोरिस सेपेसी, रेजा मेहरान और डेविड राइस को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम से कोई अतिरिक्त फंडिंग नहीं जुड़ी है।
Materials
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
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