Generering og utvidelse av primære, ondartede pleural mesoteliom tumorlinjer

Summary

Målet med denne metoden papiret er å demonstrere en robust og reproduserbar metodikk for anrikning, generering og utvidelse av primære tumorcellelinjer fra kirurgisk resektert pleural mesothelioma.

Abstract

Nåværende metoder for utvidelse av primære tumorcellelinjer fra sjeldne tumortyper mangler. Denne protokollen beskriver metoder for å utvide primære tumorceller fra kirurgisk resektert, ondartet pleural mesothelioma (MPM) ved å gi en fullstendig oversikt over prosessen fra fordøyelsen til berikelse, utvidelse, kryopreservering og fenotypisk karakterisering. I tillegg introduserer denne protokollen konsepter for tumorgenerering som kan være nyttige for flere tumortyper som differensial trypsinisering og virkningen av dissosiasjonsmetoder på påvisning av celleoverflatemarkører for fenotypisk karakterisering. Den største begrensningen i denne studien er utvalget av tumorceller som vil utvide seg i et todimensjonalt (2D) kultursystem. Variasjoner i denne protokollen, inkludert tredimensjonale (3D) kultursystemer, medietilskudd, platebelegg for å forbedre vedheft og alternative disaggregeringsmetoder, kan forbedre denne teknikken og den generelle suksessraten for å etablere en tumorlinje. Samlet sett gir denne protokollen en basismetode for å etablere og karakterisere tumorceller fra denne sjeldne svulsten.

Introduction

Ondartet pleural mesothelioma (MPM) er en sjelden svulst svært forbundet med asbest eksponering. Selv om immunterapibaserte tilnærminger har vist oppmuntrende resultater, er det mangel på behandlingsalternativer tilgjengelig for pasienter som utvikler denne sykdommen, og den totale 5-årige overlevelsesraten er lav ^1,2. Arbeidet pågår ved flere institusjoner for å bedre forstå denne sykdommen og identifisere nye terapeutiske mål som kan forbedre pasientens utfall. Mens det er flere mesothelioma musemodeller, tilgang til primære mesothelioma tumorceller er mer begrenset³. In vitro utvidelse av primære mesothelioma tumorceller ville gi en verdifull modell system som kan benyttes til å studere tumorceller direkte og deres interaksjon med autologe immunceller som tumor-infiltrerende lymfocytter. Mens det har vært rapporter om utvidelse av primære mesothelioma tumorceller linjer, disse er få og gir ikke en detaljert standard operasjon prosedyre (SOP). Videre er få cellelinjer tilgjengelige fra kommersielle kilder som American Type Culture Collection (ATCC). Mens tilgjengeligheten av primære tumorlinjer er begrenset, har det vist seg at tumorceller kan utvides fra pleural effusjoner og direkte fra tumorvevet ^4,5. I tillegg har utvidede tumorcellelinjer vist seg å bevare den molekylære profilen til den opprinnelige svulsten ^4,5,6.

Vårt laboratorium studerer tumor-immun mikromiljøet til MPM og har utviklet en metode for å utvide primære MPM-tumorcellelinjer fra kirurgisk resekterte tilfeller. Denne metoden er tilpasset fra vår erfaring med å etablere primære metastatiske melanom tumorcellelinjer. Målet med dette arbeidet er å gi en detaljert, praktisk tilnærming til primær mesoteliom tumorlinjeutvidelse ved hjelp av et 2D-modellsystem og påfølgende fenotypisk profilering. Gitt den nylige suksessen med sjekkpunktblokadestrategier rettet mot CTLA4 og PD-1 i førstelinjeinnstilling², kan evnen til å generere mange primære tumorlinjer fremme forståelsen av både tumorens inneboende motstandsmekanismer, samt gi et viktig modellsystem for å vurdere T-cellegjenkjenning, og dermed utdype vår forståelse av immunresponsen i MPM.

Den største begrensningen i denne protokollen er at hver svulst inneholder et annet mikromiljø, og det er en høy grad av variasjon i ekspansjonssuksess. I tillegg velger denne metoden for tumorceller som kan utvide seg i et 2D-kultursystem. Andre metoder som involverer produksjon av en 3D-sfæroid eller organoidkultur, kan gi en alternativ tilnærming som kan tillate en høyere suksessrate for ekspansjon eller resultere i evnen til å utlede cellelinjer som ikke klarer å utvide seg i et tradisjonelt 2D-system. Slike 3D-kulturer har vist seg å være nyttige for generering av tumortyper som er vanskelige å utvide, for eksempel kreft i bukspyttkjertelen⁷.

Protocol

Alle metodene beskrevet her er godkjent av Institution Review Board (IRB) ved University of Texas MD Anderson Cancer Center. Dette gjelder standard-of-care, kirurgisk resected MPM svulster fjernet etter informert samtykke. 1. Forberedelse av tumorfordøyelsesmedier og andre tilknyttede medier For å forberede tumorfordøyelsesmedier, tilsett 5 ml 100% penn / strep (penicillin / streptomycin) til 500 ml steril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium i en la…

Representative Results

For å bestemme fibroblastkontaminering av tidligpassasjekulturer, vurderes celler ved hjelp av et invertert fasemikroskop for å identifisere frekvensen av fibroblaster i forhold til de andre adherentcellene som er tilstede. Figur 1 viser eksempler på økende fibroblastkontaminering på 80% (figur 1A), 50% (figur 1B) og 30% (figur 1C), sammenlignet med en kultur uten fibroblastforurensning (<strong cl…

Discussion

Selv om denne protokollen er grei, er det noen få kritiske trinn som må følges nøye. Frysing av tidlig passasje er viktig for å bevare evnen til å gjenta tumorcelleberikelsesprosessen hvis den først mislykkes. Evnen til å vurdere fibroblastisk forurensning med øyet for å bestemme riktig splitting og media sult teknikk er avgjørende for å forhindre fibroblast overvekst i kulturen. I tillegg krever differensial trypsiniseringsmetoden nøye observasjon av cellene under inkubasjon. Cellene kan løfte av plastplat…

Materials

10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML