Generering och expansion av primära, maligna pleuramesoteliom tumörlinjer

Summary

Målet med denna metod är att demonstrera en robust och reproducerbar metod för anrikning, generering och expansion av primära tumörcellinjer från kirurgiskt resekterat pleuramesoteliom.

Abstract

Nuvarande metoder för expansion av primära tumörcellinjer från sällsynta tumörtyper saknas. Detta protokoll beskriver metoder för att expandera primära tumörceller från kirurgiskt resekterat, malignt pleuramesoteliom (MPM) genom att ge en fullständig översikt över processen från matsmältning till anrikning, expansion, kryokonservering och fenotypisk karakterisering. Dessutom introducerar detta protokoll begrepp för tumörgenerering som kan vara användbara för flera tumörtyper såsom differentiell trypsinisering och effekten av dissociationsmetoder vid detektering av cellytemarkörer för fenotypisk karakterisering. Den största begränsningen i denna studie är valet av tumörceller som kommer att expandera i ett tvådimensionellt (2D) odlingssystem. Variationer av detta protokoll, inklusive tredimensionella (3D) odlingssystem, medietillskott, plattbeläggning för att förbättra vidhäftningen och alternativa disaggregeringsmetoder, kan förbättra denna teknik och den totala framgångsgraden för att etablera en tumörlinje. Sammantaget ger detta protokoll en basmetod för att etablera och karakterisera tumörceller från denna sällsynta tumör.

Introduction

Malignt pleuramesoteliom (MPM) är en sällsynt tumör som är mycket associerad med asbestexponering. Även om immunterapibaserade metoder har visat uppmuntrande resultat, finns det en brist på behandlingsalternativ tillgängliga för patienter som utvecklar denna sjukdom, och den totala 5-årsöverlevnaden är låg ^1,2. Ansträngningar pågår vid flera institutioner för att bättre förstå denna sjukdom och identifiera nya terapeutiska mål som kan förbättra patientresultaten. Medan det finns flera mesoteliom mus modeller, tillgång till primär mesoteliom tumörceller är mer begränsad³. In vitro-expansion av primära mesoteliom tumörceller skulle ge ett värdefullt modellsystem som kan användas för att studera tumörceller direkt och deras interaktion med autologa immunceller såsom tumörinfiltrerande lymfocyter. Medan det har förekommit rapporter om expansionen av primära mesoteliom tumörceller linjer, dessa är få och ger inte en detaljerad standard operation förfarande (SOP). Dessutom finns få cellinjer tillgängliga från kommersiella källor som American Type Culture Collection (ATCC). Medan tillgängligheten av primära tumörlinjer är begränsad har det visat sig att tumörceller kan expanderas från pleurautgjutningar och direkt från tumörvävnaden ^4,5. Dessutom har expanderade tumörcellinjer visat sig bevara den molekylära profilen för den ursprungliga tumören ^4,5,6.

Vårt laboratorium studerar den tumörimmuna mikromiljön hos MPM och har utvecklat en metod för att expandera primära MPM-tumörceller från kirurgiskt resekterade fall. Denna metod är anpassad från vår erfarenhet av att etablera primära metastatiska melanomtumörcellinjer. Målet med detta arbete är att ge ett detaljerat, praktiskt tillvägagångssätt för primär mesoteliom tumörlinjeutvidgning med hjälp av ett 2D-modellsystem och efterföljande fenotypisk profilering. Med tanke på den senaste tidens framgång med checkpointblockadstrategier riktade mot CTLA4 och PD-1 i första linjens inställning², kan förmågan att generera många primära tumörlinjer främja förståelsen av både tumörens inneboende mekanismer för resistens samt ge ett viktigt modellsystem för att bedöma T-celligenkänning, vilket fördjupar vår förståelse av immunsvaret i MPM.

Den största begränsningen med detta protokoll är att varje tumör innehåller en annan mikromiljö, och det finns en hög grad av variation av expansionsframgång. Dessutom väljer denna metod för tumörceller som kan expandera i ett 2D-odlingssystem. Andra metoder som involverar produktion av en 3D-sfäroid eller organoidkultur kan ge ett alternativt tillvägagångssätt som kan möjliggöra en högre framgångsgrad för expansion eller resultera i förmågan att härleda cellinjer som inte kan expandera i ett traditionellt 2D-system. Sådana 3D-kulturer har visat sig vara användbara för generering av tumörtyper som är svåra att expandera, till exempel bukspottkörtelcancer⁷.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institution Review Board (IRB) vid University of Texas MD Anderson Cancer Center. Detta gäller standardvård, kirurgiskt resekterade MPM-tumörer som tagits bort efter informerat samtycke. 1. Beredning av tumörsmältningsmedier och andra associerade medier För att förbereda tumörsmältningsmedia, tillsätt 5 ml 100% Pen / Strep (Penicillin / Streptomycin) till 500 ml steril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 16…

Representative Results

För att bestämma fibroblastkontaminering av tidiga passagekulturer bedöms celler med hjälp av ett inverterat fasmikroskop för att identifiera frekvensen av fibroblaster i förhållande till de andra närvarande vidhäftande cellerna. Figur 1 visar exempel på ökande fibroblastkontaminering på 80% (figur 1A), 50% (figur 1B) och 30% (figur 1C), jämfört med en kultur utan fibroblastkontaminering (…

Discussion

Även om detta protokoll är enkelt finns det några kritiska steg som måste följas noggrant. Frysningen av tidig passage är viktig för att bevara förmågan att upprepa tumörcellsanrikningsprocessen om den initialt misslyckas. Förmågan att bedöma fibroblastisk kontaminering med ögat för att bestämma rätt splittrings- och mediasvältteknik är avgörande för att förhindra överväxt av fibroblast i kulturen. Dessutom kräver den differentiella trypsiniseringsmetoden noggrann observation av cellerna under in…

Materials

10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML