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Developmental Biology

अमेरिकी तिलचट्टा में आरएनए हस्तक्षेप के अनुप्रयोग

Published: December 17, 2021 doi: 10.3791/63380
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Guangdong Provincial Key Laboratory of Insect Developmental Biology and Applied Technology, Institute of Insect Science and Technology & School of Life Sciences, South China Normal University, 2Guangmeiyuan R&D Center, Guangdong Provincial Key Laboratory of Insect Developmental Biology and Applied Technology, South China Normal University
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल पी. अमेरिकाना में आरएनएआई ऑपरेशन तकनीकों के लिए चरण-दर-चरण दिशानिर्देशों का वर्णन करता है।

Abstract

कॉकरोच, एक सैनिटरी कीट, कीट विकास और मेटामॉर्फिक अध्ययनों में आवश्यक प्रजातियां हैं क्योंकि उनके आसान भोजन और हेमीमेटाबोलस विशेषताओं के कारण। पूरी तरह से अच्छी तरह से एनोटेट जीनोम अनुक्रमों के साथ, इन फायदों ने अमेरिकी तिलचट्टा, पेरिप्लेनेटा अमेरिकाना, एक महत्वपूर्ण हेमीमेटाबोलस कीट मॉडल बना दिया है। नॉकआउट रणनीति की कमी से सीमित, प्रभावी आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) -आधारित जीन नॉकडाउन पी अमेरिकाना के कार्यात्मक जीन अनुसंधान में एक अपरिहार्य तकनीक बन जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल पी. अमेरिकाना में आरएनएआई ऑपरेशन तकनीकों का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल में (1) उचित विकास चरणों में पी. अमेरिकाना का चयन, (2) इंजेक्शन सेटिंग के लिए तैयारी, (3) डीएसआरएनए इंजेक्शन, और (4) जीन नॉकडाउन दक्षता का पता लगाना शामिल है। आरएनएआई पी अमेरिकाना में एक शक्तिशाली रिवर्स आनुवंशिक उपकरण है। पी. अमेरिकाना ऊतकों के बहुमत extracellular dsRNA के प्रति संवेदनशील हैं। इसकी सादगी शोधकर्ताओं को एक या कई लक्ष्यीकरण डीएसआरएनए इंजेक्शन के तहत जल्दी से बेकार फेनोटाइप प्राप्त करने की अनुमति देती है, जिससे शोधकर्ताओं को विकासात्मक और रूपांतरित अध्ययनों के लिए पी. अमेरिकाना का बेहतर उपयोग करने में सक्षम बनाया जा सकता है।

Introduction

आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई), एक विकासवादी रूप से संरक्षित तंत्र, धीरे-धीरे कई जीवों में जीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए एक आवश्यक रिवर्स-आनुवंशिक उपकरण बन जाताहै 1, क्योंकि एंड्रयू फायर और क्रेग मेलो2 ने डबल-फंसे हुए आरएनए (डीएसआरएनए) मध्यस्थता जीन चुप्पी रणनीति विकसित की। dsRNA को 21-23 न्यूक्लियोटाइड्स, छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (siRNAs) के टुकड़ों में विभाजित किया जाता है, जो आरएनएआई मार्ग को सक्रिय करने के लिए कोशिकाओं में एंजाइम डाइसर द्वारा होता है। फिर siRNAs को आरएनए-प्रेरित साइलेंसिंग कॉम्प्लेक्स (RISC) में शामिल किया जाता है, जो लक्ष्य mRNA के लिए जोड़ता है, mRNA दरार का कारण बनता है, और अंत में जीन फ़ंक्शन 3,4,5 के नुकसान में परिणाम देता है। कीट प्रजातियों में, कई प्रणालीगत आरएनएआई प्रयोगों को अब तक बहुत सारे कीट आदेशों में सूचित किया गया है, जैसे कि ऑर्थोप्टेरा, आइसोप्टेरा, हेमिप्टेरा, कोलिओप्टेरा, न्यूरोप्टेरा, डिप्टेरा, हाइमेनोप्टेरा, लेपिडोप्टेरा, और ब्लैटोडिया 5,6,7,8।

कॉकरोच (ब्लैटेरिया) विकासात्मक और रूपांतरित अध्ययनों में एक आवश्यक कीट परिवार हैं, जिसमें उनके तेजी से विकास चक्र, पर्यावरण के लिए मजबूत अनुकूलन क्षमता और उच्च विकासात्मक प्लास्टिसिटी9 है। यह पता लगाने से पहले कि आरएनएआई तिलचट्टे के साथ संगत था, पिछले शोध ने केवल तिलचट्टे में आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों की कमी के कारण तिलचट्टे की रोकथाम और नियंत्रण पर ध्यान केंद्रित किया था। कॉकरोच ऊथेका की अद्वितीय संरचना ने CRISPR-Cas9 प्रणाली के साथ भ्रूण इंजेक्शन-आधारित जीन नॉकआउट करने के लिए चुनौतीपूर्ण बना दिया। इसके अलावा, तिलचट्टे में अधिकांश ऊतक (जैसे पी. अमेरिकाना) मजबूत प्रणालीगत आरएनएआई प्रतिक्रिया दिखाते हैं, जो एक या अधिक लक्ष्यीकरण dsRNAs 9,10,11 को इंजेक्ट करके बेकार फेनोटाइप की तेजी से पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। इन विशेषताओं ने आरएनएआई को पी. अमेरिकाना में जीन कार्यात्मक अनुसंधान में एक अपरिहार्य तकनीक बना दिया।

भले ही पी. अमेरिकाना में कार्यात्मक जीन अनुसंधान में आरएनएआई के उपयोग की सूचना दी गई है, कोई विस्तृत या चरण-दर-चरण विवरण उपलब्ध नहीं था। यह रिपोर्ट पी. अमेरिकाना में आरएनएआई के लिए एक चरण-दर-चरण परिचालन दिशानिर्देश प्रदान करती है, जो अन्य तिलचट्टे में जीन फ़ंक्शन अध्ययन के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, यह मार्गदर्शिका ब्लैटोडिया तक सीमित नहीं है और मामूली संशोधनों के साथ कई अन्य कीड़ों पर लागू की जा सकती है।

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Protocol

पी अमेरिकाना की लाइन शुरू में डॉ Huiling Hao द्वारा प्रदान की गई थी। इस प्रजाति को 30 वर्षों के लिए इनब्रीडिंग के साथ बनाए रखा गयाहै।

1. हैचिंग और पी. अमेरिकाना के खिला

  1. पी अमेरिकाना के ताजा oothecae (तुरंत पोस्ट अंडे देने) ले लीजिए और 25 डिग्री सेल्सियस और ~ 25 दिनों के लिए 60% आर्द्रता पर अंधेरे इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। फिर हैचिंग से पहले तापमान और आर्द्रता को 30 डिग्री सेल्सियस और 75% 3 दिन तक बढ़ाएं।
  2. 4 मिमी एपर्चर के साथ एक छलनी का उपयोग करने के लिए oothecae से hatched अप्सराओं को अलग करने के लिए।
  3. बेलनाकार कंटेनरों (व्यास में 12 सेमी और ऊंचाई में 10 सेमी) में अप्सराओं को 28 डिग्री सेल्सियस, 70% आर्द्रता पर अंधेरे में रखें। कॉकरोच को भागने से रोकने के लिए कंटेनरों के अंदर के किनारे को वैसलीन के साथ ब्रश करें। चूहे का भोजन, पानी और आश्रय (अंडे की ट्रे) प्रदान करें। अप्सराओं की गतिविधि पर ध्यान दें और नियमित रूप से मल और मलबे को साफ करें।

2. उचित instar में अप्सराओं का चयन

  1. ताजा पिघला हुआ पी अमेरिकाना (शरीर के रंग में सफेद) को चुनने के लिए एक ग्लास ट्यूब का उपयोग करें। उन्हें नए कंटेनरों में रखें और उपचार के लिए सही चरण की प्रतीक्षा करें।
    नोट: उपरोक्त खिला शर्तों के तहत ~ 19 दिनों के बाद, 3rd instars में अप्सरा इंजेक्शन के लिए उपलब्ध होंगे। ताजा पिघले हुए तिलचट्टे का रंग सफेद होता है, और इनस्टार को मोलिंग समय द्वारा स्पष्ट किया जाता है।

3. T7 प्रमोटरों के साथ लक्ष्य टुकड़ा की तैयारी

  1. एक टेम्पलेट के रूप में पी अमेरिकाना के cDNA का उपयोग करते हुए, लक्ष्य जीन9 के 300-800 बीपी डीएनए टुकड़े को प्राप्त करने के लिए पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए प्राइमरों को डिजाइन करें। फिर अनुक्रमण के लिए पीसीआर टुकड़े को एक पीटीओपीओ वेक्टर ( सामग्री की तालिका देखें) में क्लोन करें।
  2. एक टेम्पलेट के रूप में लक्ष्य टुकड़ा डीएनए का उपयोग करते हुए, 5 'टर्मिनलों पर T7 प्रमोटर अनुक्रम (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') के साथ प्राइमरों की एक नई जोड़ी को संश्लेषित करें और प्रत्येक पक्ष9 पर T7 प्रमोटरों के साथ लक्ष्य टुकड़ा प्राप्त करने के लिए पीसीआर का एक और दौर करें।

4. प्रतिलेखन और विट्रो में dsRNA के संश्लेषण

  1. प्रतिक्रिया प्रणाली में T7 2X बफर के 10 μL, एंजाइम मिक्स के 2 μL, T7 एक्सप्रेस ( सामग्री की तालिका देखें), और PCR उत्पाद के 2 μg (चरण 3.2 में प्राप्त) जोड़ें और ddH 2 O के साथ20μL में कुल मात्रा जोड़ें। धीरे से मैन्युअल रूप से उल्टा मिश्रण करें और 30 मिनट के लिए 37 °C पर और 10 मिनट के लिए 70 °C पर इनक्यूबेट करें, और फिर धीरे-धीरे कमरे के तापमान पर ठंडा हो जाता है।
  2. तनु RNase एक समाधान (4 μg / μL) के साथ ddH2O के साथ 1: 200 के अनुपात में। फिर RQ1 RNase-Free DNase (1 U/μL) के 1 μL और सिस्टम में पतला RNase A समाधान के 1 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट:: अब, एक एकल सिस्टम का आयतन 22 μL है।
  3. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर कुल आयतन का 10% जोड़ें (जब एक साथ एन प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं, तो कुल आयतन N x 22 μL है) सोडियम एसीटेट का और आइसोप्रोपेनॉल की कुल मात्रा के तीन वॉल्यूम।
  4. धीरे से मैन्युअल रूप से उल्टा मिश्रण करें, 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. एक पिपेट के साथ supernatant निकालें, 75% इथेनॉल के साथ अवशेषों को धोएं (25% diethyl pyrocarbonate (DEPC) उपचारित पानी के साथ), और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 13,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  6. supernatant फिर से निकालें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए गोली को हवा से सुखाएं। DSRNA को भंग करने के लिए DEPC पानी के ~ 100 μL का उपयोग करें, फिर dsRNA को अंतिम 2 μg / μL तक पतला करें।
    नोट: dsRNA 6 महीने के लिए -80 °C पर संग्रहीत किया जा सकता है।

5. सिरिंज में dsRNA समाधान लोड हो रहा है

  1. माइक्रो-इंजेक्शन पंप में कार्यक्रम सेट अप करें ( सामग्री की तालिका देखें) यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक इंजेक्शन की मात्रा सुसंगत है। सिरिंज का उपयोग करने से पहले, सिरिंज को 8-10 बार डीईपीसी पानी से भरकर साफ करें।
  2. माइक्रो-इंजेक्शन पंप पर 10 μL सिरिंज स्थापित करें, पंप शुरू करें, और dsRNA समाधान के 10 μL के साथ सिरिंज को भरें (चरण 4.6 पर तैयार)। DSRNA के 1 μL को 3rd instar अप्सरा में इंजेक्ट करें (चरण 2 देखें) और सुनिश्चित करें कि यह शरीर में रिसाव नहीं करता है।

6. इंजेक्शन dsRNA करने के लिए पी americana

  1. एक कंटेनर में सीओ2 की बढ़ी हुई एकाग्रता के साथ तिलचट्टे को एनेस्थेटाइज़ करें जब तक कि तिलचट्टे अब और आगे नहीं बढ़ते हैं, और फिर इंजेक्शन के साथ तुरंत आगे बढ़ें।
  2. धीरे से चिमटी के साथ तिलचट्टा उठाओ, और हाथ से सुई की ओर तिलचट्टा वितरित. इसके बाद, एपिडर्मिस के खिलाफ क्षैतिज रूप से दो पेट के सोमाइट्स के बीच के अंतर के माध्यम से सुई डालें। डालने की गहराई के बारे में, shallower, बेहतर.
  3. फिर, तिलचट्टे में dsRNA समाधान इंजेक्ट करें। अंत में, सुई की नोक को बाहर निकालें। सुनिश्चित करें कि आंतरिक अंगों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए सुई की नोक एपिडर्मिस के जितना संभव हो उतना करीब है।
    नोट: इंजेक्शन एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत किया जाना चाहिए।
  4. इंजेक्ट किए गए कॉकरोच को साफ बायोएसे कंटेनरों में डालें। उन्हें सीओ 2 प्रभावों से ठीक होने देने के लिए लगभग10-20 मिनट तक प्रतीक्षा करें। इंजेक्शन की तारीख, dsRNA के प्रकार और खुराक, और पी. americana की उम्र के साथ कंटेनरों को लेबल करें।
  5. इंजेक्ट किए गए तिलचट्टे को 28 डिग्री सेल्सियस, 70% आर्द्रता पर एक अंधेरे वातावरण में रखें, पानी, फ़ीड और आश्रय प्रदान करें, और नियमित रूप से तिलचट्टे के फेनोटाइप में संभावित परिवर्तनों का निरीक्षण करें।

7. नॉकडाउन पुष्टि और फेनोटाइपिक विश्लेषण

  1. किसी भी उपलब्ध आणविक जीव विज्ञान तकनीकों जैसे मात्रात्मक रियल-टाइम पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) और पश्चिमी ब्लोटिंग का उपयोग करके आरएनएआई की दक्षता का मूल्यांकन करें। विस्तृत qRT-PCR और पश्चिमी ब्लोटिंग प्रक्रियाओं के लिए, संदर्भ 1,12 देखें.
  2. आरएनएआई से संबंधित फेनोटाइप्स का निरीक्षण और विश्लेषण करने के लिए, जीवित जानवरों के लिए उपयुक्त माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    नोट: आरएनएआई आकृति विज्ञान, व्यवहार, मोल्टिंग, अंग पुनर्जनन और तिलचट्टे की अन्य शारीरिक गतिविधियों को प्रभावित कर सकता है। फेनोटाइप की विशिष्ट आवृत्ति की गणना विशिष्ट परिस्थितियों के अनुसार की जाती है।

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Representative Results

चित्र 1 एक सफल इंजेक्शन दिखाता है। एक माइक्रो व्यास सुई के साथ माइक्रोइंजेक्शन सिरिंज को क्षैतिज रूप से बूस्टर (चित्रा 1 ए) पर रखा जाना चाहिए। सुई को एपिडर्मिस (चित्रा 1 बी) के खिलाफ क्षैतिज रूप से दो पेट के सोमाइट्स के बीच के अंतर के माध्यम से डाला जाता है। सुनिश्चित करें कि तरल पी अमेरिकाना पेट में चला जाता है। सुई का बहुत खड़ा कोण आंतरिक अंगों (चित्रा 1 सी) को नुकसान पहुंचाएगा, और अनुचित इंजेक्शन पेट से बाहर डीएसआरएनए समाधान के रिसाव की ओर जाता है (चित्रा 1 डी)। यदि कोई डीएसआरएनए लीक होता है, तो जानवर को त्यागने की आवश्यकता होती है, और एक और इंजेक्शन किया जाता है। इंजेक्शन के दौरान पी. अमेरिकाना को पूरी तरह से एनेस्थेटिक होने की आवश्यकता होती है।

अन्य जैविक प्रयोगों की तरह, नियंत्रण समूहों की आवश्यकता होती है जब आरएनएआई उपचार किया जाता है। DSRNA के ऑफ-टारगेट प्रभावों, इंजेक्शन के दौरान क्षति, या सीओ2 संज्ञाहरण के कारण के बजाय लक्षित आरएनएआई के कारण उपचार के अंतर की पुष्टि की जानी चाहिए। यहां डीडीसी (डोपा डिकार्बोक्सिलेज) और डीपीपी (डिकापेंटाप्लेजिक) जीन को डीएसआरएनए इंजेक्शन के बाद पिघले हुए कॉकरोच के फेनोटाइप का निरीक्षण करने के लिए दो उदाहरणों के रूप में चुना गया था, और एक नकारात्मक नियंत्रण डीएसमॉक11 जिसका जानवरों में कोई लक्ष्य नहीं है, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, आरएनएआई दक्षता का पता क्यूआरटी-पीसीआर (चित्रा 2) द्वारा लगाया गया था। एक उदाहरण के रूप में डी एसडीडीसी के इंजेक्शन को लेते हुए (चित्रा 3 ए, बी), डीडीसी जीन को गिराने के साथ पी. अमेरिकाना में लंबे समय तक सफेद एपिडर्मिस होगा क्योंकि मेलेनाइजेशन अवरुद्ध हो गया है (चित्रा 3 बी)। डी एसडीपीपी इंजेक्शन के प्रयोग में, जो अंग पुनर्जनन के लिए आवश्यक हैं, आरएनएआई ने अंग पुनर्जनन (चित्रा 4) को बाधित किया, जिसे पहले9 बताया गया था।

Figure 1
चित्र 1: उपकरण और सही इंजेक्शन ऑपरेशन। (ए) माइक्रोइंजेक्शन उपकरण पर सिरिंज। (बी) इंजेक्शन सुई की सही स्थिति; कोई तरल पदार्थ बाहर नहीं आता है। (सी) इंजेक्शन सुई का बहुत खड़ा कोण आंतरिक अंगों को नुकसान पहुंचा सकता है। (डी) असफल इंजेक्शन के परिणामस्वरूप डीएसआरएनए समाधान या हेमोलिम्फ बह रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: आरएनएआई दक्षता क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा पता लगाया गया। डीडीसी और डीपीपी जीन की नॉकडाउन दक्षता का पता क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा लगाया गया था, और डीएसमॉक का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। प्रत्येक उपचार के लिए तीन प्रतिकृतियों का उपयोग किया गया था, और त्रुटि सलाखों ने तीन प्रतिकृतियों के मानक विचलन को इंगित किया था। मतभेदों के महत्व का विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट द्वारा किया गया था। *: पी < 0.05, **: पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पी. अमेरिकाना में एपिडर्मिस मेलेनाइजेशन के विघटन के लिए सफल आरएनएआई के उदाहरण( ए) सामान्य मेलेनाइजेशन के साथdsMock के इंजेक्शन के बाद सामान्य तिलचट्टा। (बी) डीडीसी आरएनएआई ने मोल्टिंग के बाद अल्बिनिस्टिक पी. अमेरिकाना की मध्यस्थता की। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: P. Americana में अंग पुनर्जनन के विघटन के लिए सफल RNAI के उदाहरण. (A) A . P. Americana एक कटे हुए हिंद पैर के साथ। (B-C) RNAI उपचार और मोल्टिंग के बाद P. Americana . हिंडलेग को डीएसमॉक कंट्रोल ग्रुप (बी) में पुनर्जीवित किया गया था, लेकिन जब डीपीपी (सी) जीन को चुप नहीं किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस रिपोर्ट में पी. अमेरिकाना में एक पद्धतिगत चरण-दर-चरण आरएनएआई रणनीति का वर्णन किया गया है; ध्यान दें, यह भी अन्य तिलचट्टे (Blattella germanica, उदाहरण के लिए) और मामूली परिवर्तन के साथ कई अन्य कीड़ों के लिए लागू किया जा सकता है. हालांकि, आरएनएआई की जीन मौन दक्षता हमेशा पर्याप्त रूप से उच्च नहीं होती है, जीन नॉकआउट रणनीति13 की तुलना में एक स्पष्ट नुकसान के साथ। जीन-स्तर का निम्नलिखित अवशिष्ट प्रभाव वास्तविक फेनोटाइप के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि आरएनएआई उपचार सफल है, कई आवश्यक स्थितियों पर विचार करने की आवश्यकता है, जिसमें जानवरों की शारीरिक स्थिति, नियंत्रण समूह का चयन, डीएसआरएनए अणुओं की लंबाई और एकाग्रता, ऑफ-टारगेट इफेक्ट्स (ओटीई) की संभावना से बचना, और डीएसआरएनए के लिए ऊतकों की विभिन्न संवेदनशीलता शामिल है।

पी. अमेरिकाना की शारीरिक स्थिति
स्वस्थ जानवर आरएनएआई की सफलता और पी अमेरिकाना में विभिन्न जीन कार्यात्मक अध्ययनों के लिए आधार हैं। इसके अलावा, प्रयोगों को सुसंगत रखने के लिए, केवल तिलचट्टे जो एक ही स्थिति में उठाए गए हैं, उन्हें चुना जाता है। और केवल अप्सराएं जो 3rd instar (लगभग 19 दिनों के बाद हैचिंग) से पुरानी हैं, उनका उपयोग किया जा सकता है क्योंकि छोटे अप्सरा शरीर के आकार में इंजेक्शन के लिए बहुत छोटे होते हैं।

नियंत्रण समूह का चयन
डी एसमॉक11 और डीएसईजीएफपी और तिलचट्टे लवणीय 6 की एक ही खुराक का उपयोग नकारात्मक नियंत्रणके रूप में किया गया है। नकारात्मक नियंत्रण के लक्ष्य अनुक्रम बहिर्जात होने चाहिए और अंतर्जात आनुवंशिक अनुक्रम11 के साथ कोई होमोलॉजी नहीं होनी चाहिए। डीएसमॉक को प्राथमिकता दी गई थी क्योंकि डीएसईजीएफपी का उपयोग करने से पी. अमेरिकाना के विकास और विकास में एक निश्चित डिग्री तक देरी होगी।

dsRNA लंबाई
आरएनएआई की दक्षता डीएसआरएनए अणुओं की लंबाई से प्रभावित होती है। लंबे समय तक dsRNA टुकड़े mRNA मौन पर अधिक प्रभावी होते हैं, संभवतः क्योंकि यह अधिक siRNAs का उत्पादन करता है, या छोटे dsRNA टुकड़े कोशिकाओं द्वारा कम कुशलता से लिए जाते हैं 1। पी अमेरिकाना और बी जर्मनिका में, 300 बीपी और 800 बीपी के बीच डीएसआरएनए आरएनएआई प्रयोगों 6,9,10,14 के लिए आदर्श प्रतीत होता है। एक छोटा dsRNA एक प्रणालीगत RNAAi प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए अपर्याप्त हो सकता है, जबकि एक लंबा dsRNA OTE जोखिम 1 को बढ़ा सकताहै।

dsRNA सांद्रता
DSRNA की एकाग्रता भी RNAI1,15 की दक्षता को प्रभावित कर सकती है। पी. अमेरिकाना के 3rd instar अप्सराओं के लिए, dsRNA का 1 μg एक उचित राशि प्रतीत होता है, और 4-6 μg वयस्क 6,9,14,16 के लिए उपयुक्त है। इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली सटीक dsRNA राशि को जीन, ऊतकों और पी. अमेरिकाना के शरीर के आकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।

ऑफ-टारगेट प्रभाव
आरएनएआई के ओटीई को पूरी तरह से17,18 से बचना मुश्किल है। डीएसआरएनए के दो गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों को फेनोटाइप5 पर ओटीई के प्रभाव को कम करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। यदि दो अलग-अलग क्षेत्रों को लक्षित करने वाले डीएसआरएनए एक ही प्रभाव का उत्पादन करते हैं, तो ओटीई-प्रेरित झूठी सकारात्मक घटना की संभावना को बाहर रखा जा सकता है।

आरएनएआई दक्षता का पता लगाने के लिए विधि
फेनोटाइपिक विश्लेषण आरएनएआई का मूल्यांकन करने के लिए सबसे सहज दृष्टिकोण है, और क्यूआरटी-पीसीआर और पश्चिमी ब्लोटिंग विश्लेषण नॉकडाउन दक्षता को मापने के लिए दो सुनहरे मानक हैं। qRT-PCR mRNA स्तर 6,9,10 पर हस्तक्षेप दक्षता निर्धारित करने के लिए एक सरल विधि है। प्राइमरों को dsRNA लक्ष्यीकरण क्षेत्र से बाहर डिजाइन किया जाना चाहिए। पश्चिमी ब्लोटिंग विश्लेषण प्रोटीन-स्तर के हस्तक्षेप का विश्लेषण करने के लिए एक और तरीका है लेकिन विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है। हालांकि, कोई विशेष फेनोटाइपिक प्रभाव कभी-कभी नहीं देखा जाता है, यहां तक कि उच्च मौन दक्षता (>90%) के साथ भी। इस अवशिष्ट प्रभाव के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण कॉकरोच में बड़े पैमाने पर जीन परिवार का विस्तार है; जीन की निरर्थकताएं कई विशेष कार्यों और फेनोटाइप्स को नियंत्रित करती हैं। एक और संभावित स्पष्टीकरण यह है कि कार्यात्मक पर्याप्त के लिए आवश्यक न्यूनतम जीन अभिव्यक्ति स्तर बेहद कम है। ये उच्च पर्याप्त आरएनएआई दक्षता के साथ भी एक विशेष फेनोटाइप प्राप्त करने में विफलता का कारण बनते हैं।

आरएनएआई संवेदनशीलता के लिए ऊतक-विशिष्टता
कुछ तिलचट्टे के ऊतकों (जैसे अंडाशय और गौण ग्रंथियों) में हस्तक्षेप दक्षता पर्याप्त रूप से उच्च नहीं है, जो डीएसआरएनए 5,19 के लिए मर्मज्ञ बाधा हो सकती है; विभिन्न कीट प्रजातियों में विभिन्न आरएनएआई प्रभावकारिता भी देखी जाती है, जो हेमोलिम्फ15,20 में डीएसआरएनए के एंजाइमेटिक गिरावट पर निर्भर करती है। पी. अमेरिकाना ऊतकों में आरएनएआई दक्षता में सुधार के लिए कुछ विचार उचित हैं, जैसे कि विट्रो21 में एसआईआरएनए में डीएसआरएनए को पचाना, डीएसआरएनए खुराक और इंजेक्शन के समय में वृद्धि करना, और वितरण के लिए वाहक के रूप में नैनोमैटेरियल्स का उपयोग करना।

अंत में, अच्छी तरह से एनोटेटेड जीनोम अनुक्रमों के साथ आरएनएआई की उच्च दक्षता9 पी. अमेरिकाना को विकासात्मक, शारीरिक और व्यवहारिक अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला में जीन फ़ंक्शन की जांच के लिए एक अच्छा मॉडल बनाती है। इसी तरह, यह रिपोर्ट dsRNA के प्रति संवेदनशील अन्य कीड़ों के लिए एक मूल्यवान संदर्भ के रूप में काम कर सकती है और नॉकआउट उत्परिवर्तन करना मुश्किल है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 32070500, 31620103917, 31330072, और C.R., Sh.L.) के लिए 31572325 द्वारा समर्थित किया गया था, गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2021B1515020044 और 2020A1515011267 को C.R.), गुआंग्डोंग प्रांत में विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा (अनुदान 202102020110 संख्या 201515011267) द्वारा, गुआंग्डोंग प्रांत में विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा (अनुदान संख्या 201515011267) द्वारा, गुआंग्डोंग प्रांत में विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा (अनुदान संख्या 201909000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम द्वारा (अनुदान सं। KQTD20180411143628272 करने के लिए Sh.L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
701 N 10 µL Syr (26s/51/2) Hamilton PN:80300 Injection
Incubator Ningbo Jiangnan Instrument Factory RXZ-380A-LED For cockroaches hatching and feeding
Micro-injection pump Alcott Biotechnology ALC-IP600 Injection
pTOPO-Blunt Cloning Kit Aidlab Biotechnology CV16 For Gene clonging
quantitative Real-Time PCR Systems Bio-Rad CFX Connect For qRT-PCR analysis
T7 RiboMAX Express RNAi System Promega P1700 For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase
Thermal Cyclers Bio-Rad S1000 For DNA amplification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 178 dsRNA RNAI इंजेक्शन तिलचट्टे
अमेरिकी तिलचट्टा में आरएनए हस्तक्षेप के अनुप्रयोग
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Li, L., Jing, A., Xie, M., Li, S.,… More

Li, L., Jing, A., Xie, M., Li, S., Ren, C. Applications of RNA Interference in American Cockroach. J. Vis. Exp. (178), e63380, doi:10.3791/63380 (2021).

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