Summary
Den nåværende protokollen beskriver trinnvise retningslinjer for RNAi-operasjonsteknikkene i P. americana.
Abstract
, et sanitært, er essensielle arter i insektutviklings- og metamorfiske studier på grunn av deres enkle fôring og hemimetabolske egenskaper. Til sammen med godt kommenterte genomsekvenser har disse fordelene gjort amerikansk, Periplaneta americana, en viktig hemimetabolsk insektmodell. Begrenset av mangelen på knockout strategi, effektiv RNA interferens (RNAi)-basert gen knockdown blir en uunnværlig teknikk i funksjonell genforskning av P. americana. Den nåværende protokollen beskriver RNAi operasjonsteknikker i P. americana. Protokollen inkluderer (1) valg av P. americana på riktige utviklingsstadier, (2) forberedelse til injeksjonsinnstillingen, (3) dsRNA-injeksjon og (4) gen knockdown effektivitetsdeteksjon. RNAi er et kraftig omvendt genetisk verktøy i P. americana. De fleste P. americana vev er følsomme for ekstracellulær dsRNA. Dens enkelhet gjør det mulig for forskere å raskt få dysfunksjonelle fenotyper under en eller flere målretting dsRNA injeksjoner, slik at forskere bedre kan bruke P. americana for utviklings- og metamorfiske studier.
Introduction
RNA-interferens (RNAi), en evolusjonært bevart mekanisme, blir gradvis et viktig omvendt genetisk verktøy for å hemme genuttrykk i mange organismer1, siden Andrew Fire og Craig Mello2 utviklet den dobbeltstrengede RNA (dsRNA) medierte gentaushetsstrategien. dsRNA er spaltet inn i fragmenter av 21-23 nukleotider, små forstyrrende RNAer (siRNAer), av enzymet Dicer i celler for å aktivere RNAi-banen. Deretter blir siRNAer innlemmet i det RNA-induserte silencingkomplekset (RISC), som par til målet mRNA, forårsaker mRNA-spalting, og til slutt resulterer i tap av genfunksjon 3,4,5. Blant insektsartene har mange systemiske RNAi-eksperimenter så langt blitt rapportert i mange insektordrer, som Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera og Blattodea 5,6,7,8.
(Blattaria) er en viktig insektfamilie i utviklings- og metamorfiske studier med sine raske vekstsykluser, sterk tilpasningsevne til miljøet og høy utviklingsplastisitet9. Før du oppdager at RNAi var kompatibel med, fokuserte tidligere forskning bare på kakerlakkforebygging og kontroll på grunn av knapphet på genetiske manipulasjonsteknikker i. oothecas unike struktur gjorde det utfordrende å utføre embryoinjeksjonsbasert gen knockout med CRISPR-Cas9-systemet. Dessuten viser de fleste vev i (som P. americana) robust systemisk RNAi-respons, noe som gir rask generering av dysfunksjonelle fenotyper ved å injisere en eller flere målrettede dsRNAer 9,10,11. Disse funksjonene gjorde RNAi til en uunnværlig teknikk i genfunksjonell forskning i P. americana.
Selv om bruk av RNAi i funksjonell genforskning i P. americana er rapportert, var det ingen detaljert eller trinnvis beskrivelse tilgjengelig. Denne rapporten gir en trinnvis operasjonell retningslinje for RNAi i P. americana, nyttig for genfunksjonsstudie i andre. Videre er denne guiden ikke begrenset til Blattodea og kan brukes på mange andre insekter med mindre modifikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Linjen av P. americana ble opprinnelig levert av Dr. Huiling Hao. Denne arten har blitt opprettholdt med innavl i 30 år9.
1. Klekking og fôring av P. americana
- Samle fersk oothecae (umiddelbart post egglegging) av P. americana og inkuber i den mørke inkubatoren ved 25 °C og 60 % fuktighet i ca. 25 dager. Øk deretter temperaturen og fuktigheten til 30 °C og 75 % 3 dager før klekking.
- Bruk en sil med 4 mm blenderåpning for å skille de klekkede nymfene fra oothecae.
- Hold nymfene i sylindriske beholdere (12 cm i diameter og 10 cm i høyden) i mørket ved 28 °C, 70 % fuktighet. Pensle den indre kanten av beholderne med vaselin for å forhindre at unnslipper. Gi rottemat, vann og ly (eggbrett). Vær oppmerksom på nymfers aktivitet og rengjør regelmessig avføring og rusk.
2. Valg av nymfer i riktig instar
- Bruk et glassrør for å plukke ut den nymalte P. americana (hvit i kroppsfarge). Hold dem i nye beholdere og vent på riktig stadium for behandling.
MERK: Etter ~ 19 dager under de ovennevnte fôringsforholdene, vil nymfene i 3rd instars være tilgjengelige for injeksjon. Fargen på nysmeltede er hvit, og instars er avklart ved smeltetider.
3. Forberedelse av målfragmentet med T7-promotører
- Ved hjelp av cDNA av P. americana som mal, design parret primere for å utføre PCR for å oppnå 300-800 bp DNA fragment av målet gen9. Klone deretter PCR-fragmentet i en pTOPO-vektor (se Materialtabell) for sekvensering.
- Bruk målfragment-DNA-et som mal, syntetiser et nytt par primere med T7-promotorsekvens (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') på 5's terminaler og utfør en ny runde PCR for å oppnå målfragmentet med T7-promotorer på hver side9.
4. Transkripsjon og syntese av dsRNA in vitro
- Tilsett 10 μL T7 2X buffer, 2 μL av enzymeblandingen, T7 Express (se materialtabell) og 2 μg PCR-produkt (oppnådd i trinn 3.2) i reaksjonssystemet og tilsett det totale volumet til 20 μL med ddH2O. Bland forsiktig opp ned manuelt og inkuber ved 37 °C i 30 minutter og 70 °C i 10 minutter, min. og deretter sakte avkjøles til romtemperatur.
- Fortynn RNase A-oppløsning (4 μg/μL) med ddH2O ved et forhold på 1:200. Tilsett deretter 1 μL RQ1 RNase-Free DNase (1 U/μL) og 1 μL fortynnet RNase A-løsning i systemet (se Materialfortegnelse).
MERK: Nå er volumet av et enkelt system 22 μL. - Inkuber ved 37 °C i 30 minutter. Tilsett deretter 10% av det totale volumet (når du utfører N-reaksjoner samtidig, er det totale volumet N x 22 μL) natriumacetat og tre volumer av det totale volumet av isopropanol.
- Bland forsiktig opp ned manuelt, legg på is i 5 min, og sentrifuger ved 13 000 x g i 10 min ved 4 °C.
- Fjern supernatanten med en pipette, vask restene med 75% etanol (med 25% dietylpyrokarbonat (DEPC) behandlet vann), og sentrifuger deretter ved 13.000 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern supernatant igjen. Lufttørk pelletsen i 15 min ved romtemperatur. Bruk ~100 μL DEPC vann for å oppløse dsRNA, og fortynn deretter dsRNA til den endelige 2 μg / μL.
MERK: dsRNA kan oppbevares ved -80 °C i 6 måneder.
5. Lasting av dsRNA-oppløsning i sprøyten
- Sett opp programmet i mikroinjeksjonspumpen (se Materialtabell) på forhånd for å sikre at volumet av hver injeksjon er konsistent. Før du bruker sprøyten, rengjør sprøyten ved å fylle den med DEPC-vann 8-10 ganger.
- Installer 10 μL sprøyten på mikroinjeksjonspumpen, start pumpen og fyll sprøyten med 10 μL dsRNA-oppløsning (fremstilt i trinn 4.6). Injiser 1 μL av dsRNA i en 3rd instar nymfe (se trinn 2) og sørg for at den ikke lekker ut til kroppen.
6. Injisere dsRNA til P. americana
- Bedøv med en økt konsentrasjon av CO2 i en beholder til ikke beveger seg lenger, og fortsett deretter umiddelbart med injeksjonen.
- Plukk forsiktig opp med pinsett, og lever mot nålen med hånden. Deretter setter du nålen via gapet mellom to bukdritt horisontalt mot epidermis. Om sett inn dybde, grunnere, jo bedre.
- Injiser deretter dsRNA-løsningen i. Til slutt trekker du ut nålespissen. Sørg for at nålespissen er så nær epidermis som mulig for å unngå å skade indre organer.
MERK: Injeksjonen skal gjøres under et disseksjonsmikroskop. - Sett de injiserte i rene bioassay beholdere. Vent i ca 10-20 min for å la dem komme seg etter CO2-effektene . Merk beholderne med dato for injeksjon, type og dose dsRNA, og alder av P. americana.
- Plasser de injiserte i et mørkt miljø ved 28 °C, 70 % fuktighet, gi vann, fôr og ly, og observer mulige endringer i fenotype regelmessig.
7. Knockdown-bekreftelse og fenotypisk analyse
- Evaluer effektiviteten til RNAi ved hjelp av tilgjengelige molekylærbiologiske teknikker som kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR) og vestlig blotting. Hvis du vil ha detaljerte qRT-PCR- og western-blottingsprosedyrer, kan du se Referanse 1,12.
- For å observere og analysere RNAi-relaterte fenotyper, bruk mikroskopet som er egnet for levende dyr.
MERK: RNAi kan påvirke morfologi, oppførsel, smelting, lemregenerering og andre fysiologiske aktiviteter av. Den spesifikke frekvensen av fenotype beregnes i henhold til spesifikke forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en vellykket injeksjon. Mikroinjeksjonssprøyten med en nål med mikrodiameter skal plasseres horisontalt på boosteren (figur 1A). Nålen settes inn via gapet mellom to abdominale somitter horisontalt mot epidermis (figur 1B). Pass på at væsken går inn i P. americana magen. Den for bratte vinkelen på nålen vil skade de indre organene (figur 1C), og feil injeksjon fører til lekkasje av dsRNA-løsningen ut av magen (figur 1D). Hvis noen dsRNA lekker ut, må dyret kastes, og en annen injeksjon utføres. P. americana må være helt bedøvet under injeksjonen.
Som andre biologiske eksperimenter er det nødvendig med kontrollgrupper når RNAi-behandling utføres. Behandlingsforskjellene må bekreftes forårsaket av målrettet RNAi i stedet for på grunn av off-target effektene av dsRNA, skaden under injeksjonen, eller CO2 anestesi. Her ble Ddc (Dopa decarboxylase) og Dpp (decapentaplegic) gener valgt som to eksempler for å observere fenotypen til de smeltede etter dsRNA-injeksjon, og en negativ kontroll dsMock11 som ikke har noe mål hos dyrene, ble utført som en negativ kontroll, RNAi-effektiviteten ble oppdaget av qRT-PCR (figur 2). Ved å ta injeksjonen av dsDdc som et eksempel (figur 3A,B), ville P. americana med nedslått Ddc-gen ha den hvite epidermis i lang tid siden melaniseringen er blokkert (figur 3B). I forsøket med dsDpp-injeksjoner, som er nødvendige for lemregenerering, forstyrret RNAi lemregenereringen (figur 4), som ble rapportert tidligere9.
Figur 1: Instrument og korrekt injeksjonsoperasjon. (A) Sprøyten på mikroinjeksjonsinstrumentet. (B) Riktig posisjon av injeksjonsnålen; ingen væske kommer ut. (C) Den for bratte vinkelen på injeksjonsnålen kan skade de indre organene. (D) Mislykket injeksjon resulterer i at dsRNA-oppløsningen eller hemolymfen strømmer ut. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: RNAi-effektivitet oppdaget av qRT-PCR. Nedslagseffektiviteten til Ddc - og Dpp-gener ble oppdaget av qRT-PCR, og dsMock ble brukt som en negativ kontroll. Tre replikeringer ble brukt til hver behandling, og feilfeltene indikerer standardavviket for de tre replikeringene. Betydningen av forskjeller ble analysert ved Students t-test. *: P < 0,05, **: P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempler på vellykket RNAi for forstyrrelse av epidermis melanisering i P. americana. (A) Normal etter injeksjon avdsMock med normal melanisering. (B) Ddc RNAi formidlet albinistisk P. americana etter smelting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempler på vellykket RNAi for forstyrrelse av lemregenerering i P. americana. (A) A P. americana med amputert bakben. (B-C) P. americana etter RNAi-behandlinger og smelting. Hindlegen ble regenerert i dsMock kontrollgruppe (B), men ikke når Dpp (C) genet ble stilnet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapporten beskrev en metodisk trinnvis RNAi-strategi i P. americana; Vær oppmerksom på at den også kan brukes på andre (for eksempel Blattella germanica ) og mange andre insekter med mindre endringer. Genaktiveringseffektiviteten til RNAi er imidlertid ikke alltid høy nok, med en åpenbar ulempe sammenlignet med gen knockout-strategien13. Følgende gjenværende effekt av gennivå kan forstyrre de virkelige fenotypene. For å sikre at RNAi-behandlingen er vellykket, må flere viktige forhold vurderes, inkludert dyrs fysiske tilstand, valg av kontrollgruppe, lengden og konsentrasjonen av dsRNA-molekylene, unngå muligheten for off-target effekter (OTE), og forskjellig følsomhet for vev til dsRNA.
Fysisk tilstand av P. americana
Friske dyr er premisset for suksessen til RNAi og forskjellige genfunksjonelle studier i P. americana. Dessuten, for å holde eksperimenter konsistente, velges bare som har blitt hevet under samme forhold. Og bare nymfer som er eldre enn 3rd instar (ca. 19 dager etter klekking) kan brukes fordi yngre nymfer er for små til injeksjon i kroppsstørrelse.
Valg av kontrollgruppe
dsMock11 og dsEGFP og samme dose saltvann6 har blitt brukt som negative kontroller. Målsekvensene for negative kontroller skal være eksogene og har ingen homologi med den endogene genetiske sekvensen11. dsMock ble foretrukket fordi bruk av dsEGFP ville forsinke veksten og utviklingen av P. americana til en viss grad.
dsRNA lengde
Effektiviteten til RNAi påvirkes av lengden på dsRNA-molekylene. Lengre dsRNA-fragmenter er mer effektive ved mRNA-silencing, muligens fordi det produserer flere siRNAer, eller kortere dsRNA-fragmenter tas opp av celler mindre effektivt 1. I P. americana og B. germanica virker dsRNA mellom 300 bp og 800 bp ideell for RNAi-eksperimenter 6,9,10,14. En kort dsRNA kan være utilstrekkelig til å indusere en systemisk RNAi-respons, mens en lang dsRNA kan øke OTE-risikoen1.
dsRNA-konsentrasjon
Konsentrasjonen av dsRNA kan også påvirke effektiviteten til RNAi 1,15. For 3rd instar nymfer av P. americana, 1 μg dsRNA synes å være en rimelig mengde, og 4-6 μg er egnet for voksne 6,9,14,16. Den nøyaktige dsRNA-mengden som brukes til injeksjon kan justeres basert på genene, vevet og kroppsstørrelsen til P. americana.
Off-target effekter
OTE av RNAi er vanskelig å unngå til sammen17,18. To ikke-overlappende områder av dsRNA kan utformes for å redusere effekten av OTE på fenotyper5. Hvis dsRNAer rettet mot to forskjellige regioner gir samme effekt, kan muligheten for OTE-indusert falskt positivt fenomen utelukkes.
Metode for RNAi effektivitetsdeteksjon
Fenotypisk analyse er den mest intuitive tilnærmingen for evaluering av RNAi, og qRT-PCR og western blotting analyse er de to gylne standardene for måling av knockdown effektivitet. qRT-PCR er en enkel metode for å bestemme interferenseffektivitet på mRNA-nivå 6,9,10. Primerne bør utformes ut av dsRNA-målrettingsområdet. Den vestlige blotting analysen er en annen metode for å analysere protein-nivå interferens, men krever spesifikke antistoffer. Imidlertid observeres ingen spesielle fenotypiske effekter noen ganger, selv med høy silencingeffektivitet (>90%). En mulig forklaring på denne gjenværende effekten er massiv genfamilieutvidelse i kakerlakker; generens oppsigelser kontrollerer mange spesielle funksjoner og fenotyper. En annen mulig forklaring er at det minste genuttrykksnivået som kreves for å fungere nok, er ekstremt lavt. Disse fører til svikt i å oppnå en bestemt fenotype selv med høy nok RNAi effektivitet.
Vevsspesifikkitet for RNAi-følsomheten
Interferenseffektiviteten i noen kakerlakkvev (som eggstokk- og tilbehørskjertlene) er ikke høy nok, noe som kan være den gjennomtrengende barrieren for dsRNA 5,19; Den forskjellige RNAi-effekten i forskjellige insektarter observeres også, noe som avhenger av den enzymatiske nedbrytningen av dsRNA i hemolymf15,20. Noen få ideer er rimelige for å forbedre RNAi effektivitet i P. americana vev, for eksempel fordøye dsRNA i siRNAs in vitro21, øke dsRNA dose og injeksjon ganger, og bruke nanomaterialer som bærer for levering.
Avslutningsvis gjør den høye effektiviteten til RNAi sammen med godt kommenterte genomsekvenser9 P. americana til en god modell for å undersøke genfunksjon i et bredt spekter av utviklings-, fysiologiske og atferdsstudier. På samme måte kan denne rapporten tjene som en verdifull referanse for andre insekter som er følsomme for dsRNA og vanskelig å lage knockout-mutasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 og 31572325 til C.R., Sh.L.), av Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen (Grant No. 2021B1515020044 og 2020A1515011267 til C.R.), av Institutt for vitenskap og teknologi i Guangdong-provinsen (Grant Nos. 2019B090905003 og 2019A0102006), av Institutt for vitenskap og teknologi i Guangzhou (Grant No. 202102020110), av Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 til Sh.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
