विवो में संयुक्त दो फोटॉन प्रतिदीप्ति और उत्तेजित रमन प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी के साथ जैविक ऊतकों की इमेजिंग
Summary
उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी विशिष्ट रासायनिक बांडों के अपने आंतरिक कंपन के आधार पर बायोमोलेक्यूल्स के लेबल-मुक्त इमेजिंग की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में, एक एकीकृत एसआरएस और दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के वाद्य सेटअप को जीवित चूहों की रीढ़ की हड्डी में सेलुलर संरचनाओं की कल्पना करने के लिए वर्णित किया गया है।
Abstract
उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी आंतरिक आणविक कंपन के आधार पर अपने प्राकृतिक माइक्रोएन्वायरमेंट में जैविक ऊतकों के लेबल-मुक्त इमेजिंग को सक्षम बनाता है, इस प्रकार उपकोशिकीय संकल्प पर जैविक प्रक्रियाओं के विवो अध्ययन के लिए एक आदर्श उपकरण प्रदान करता है। एसआरएस माइक्रोस्कोप में दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति (टीपीईएफ) इमेजिंग को एकीकृत करके, ऊतकों के विवो इमेजिंग में दोहरी-मोडल कई दृष्टिकोणों से महत्वपूर्ण जैव रासायनिक और बायोफिजिकल जानकारी प्राप्त कर सकती है जो सेलुलर चयापचय, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ऊतक रीमॉडलिंग, आदि में शामिल गतिशील प्रक्रियाओं को समझने में मदद करती है। इस वीडियो प्रोटोकॉल में, एक TPEF-SRS माइक्रोस्कोप सिस्टम के सेटअप के साथ-साथ पशु रीढ़ की हड्डी की इन विवो इमेजिंग विधि पेश की जाती है। रीढ़ की हड्डी, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के हिस्से के रूप में, मस्तिष्क और परिधीय तंत्रिका तंत्र के बीच संचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। माइलिन म्यान, फॉस्फोलिपिड्स में प्रचुर मात्रा में, अक्षतंतु को चारों ओर से घेरता है और कार्रवाई क्षमता के नमकीन चालन की अनुमति देने के लिए इन्सुलेट करता है। रीढ़ की हड्डी में माइलिन म्यान के विवो इमेजिंग में न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों और रीढ़ की हड्डी की चोट की प्रगति का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल पशु तैयारी और विवो TPEF-SRS इमेजिंग विधियों में उच्च रिज़ॉल्यूशन जैविक छवियों को प्राप्त करने के लिए भी वर्णन करता है।
Introduction
रमन माइक्रोस्कोपी 1,2 बायोमोलेक्यूल्स में विभिन्न रासायनिक बांडों की विशेषता आवृत्तियों के आधार पर जैविक ऊतकों की छवि के लिए एक शक्तिशाली लेबल-मुक्त विधि के रूप में उभर रहा है। अपनी गैर-इनवेसिव और अच्छी तरह से अनुकूली इमेजिंग क्षमता के कारण, रमन माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से जैविक ऊतकों में लिपिड-समृद्ध घटकों जैसे माइलिन म्यान 3,4,5, एडिपोसाइट्स 6,7, और लिपिड ड्रॉपलेट्स 8,9,10 में इमेजिंग लिपिड-समृद्ध घटकों के लिए उपयोग किया गया है। . उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) सिग्नल प्रेरित रमन लाभ (एसआरजी) या उत्तेजित रमन हानि (एसआरएल) के रूप में अधिग्रहित पृष्ठभूमि-मुक्त है, जो सहज रमन प्रकीर्णन 11,12 के लिए सही वर्णक्रमीय समानता दिखाता है। इसके अलावा, एसआरएल और एसआरजी रैखिक रूप से विश्लेषक एकाग्रता पर निर्भर हैं, जो जैव रासायनिक घटकों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं9,11,13। दो फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TPEF) व्यापक रूप से अपनी अंतर्निहित ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता, गहरी पैठ गहराई, और कम phototoxicity14,15,16 के कारण विवो जैविक इमेजिंग में के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, TPEF इमेजिंग का प्रदर्शन फ्लोरोसेंट टैग की विशेषताओं पर निर्भर करता है, और ब्रॉडबैंड प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा 8,17,18,19 के कारण समाधान योग्य रंगों की संख्या सीमित है। लेबल-मुक्त एसआरएस इमेजिंग और प्रतिदीप्ति-आधारित टीपीईएफ इमेजिंग दो पूरक इमेजिंग तरीके हैं, और उनका संयोजन ऊतकों की प्रचुर मात्रा में बायोफिजिकल और जैव रासायनिक जानकारी प्रदान कर सकता है। ये दो इमेजिंग तौर-तरीके दोनों नॉनलाइनर ऑप्टिकल (एनएलओ) प्रक्रियाओं पर आधारित हैं, जो एक माइक्रोस्कोप सिस्टम में सरल एकीकरण की अनुमति देता है। एसआरएस और टीपीईएफ इमेजिंग का संयोजन, तथाकथित दोहरी-मोडल इमेजिंग, उच्च आयामी इमेजिंग और कोशिकाओं और ऊतकों की प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाता है, जिससे जटिल जैविक प्रणालियों की व्यापक समझ की सुविधा मिलती है। विशेष रूप से, पिकोसेकंड (पीएस) एसआरएस माइक्रोस्कोपी फेम्टोसेकंड (एफएस) एसआरएस तकनीक 11 की तुलना में उच्च वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन के साथ रासायनिक-बॉन्ड इमेजिंग प्राप्त कर सकती है, जिससे जैविक ऊतक में कई जैव रासायनिक घटकों को अलग करने की अनुमति मिलती है, विशेष रूप से भीड़ भरे फिंगरप्रिंट क्षेत्र में 20,21। इसके अलावा, सुसंगत विरोधी स्टोक्स प्रकीर्णन (CARS) माइक्रोस्कोप के एकीकरण के साथ एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया दोहरी मोडल NLO माइक्रोस्कोप प्रणाली के साथ तुलना में, SRS वर्णक्रमीय और छवि व्याख्या के साथ-साथ पता लगाने संवेदनशीलता 11 के मामले में CARS के लिए बेहतर प्रदर्शन दिखाता है। एसआरएस-टीपीईएफ माइक्रोस्कोप का उपयोग विभिन्न जैविक प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में किया गया है, जैसे कि केनोरहाबडिटिस एलिगेंस 9,22, ज़ेनोफस लेविस टैडपोल ब्रेन 5, माउस ब्रेन 23,24, रीढ़ की हड्डी 25,26, परिधीय तंत्रिका 27, और वसा ऊतक 7, आदि।
मस्तिष्क के साथ रीढ़ की हड्डी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) बनाती है। शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों के तहत विवो में सीएनएस में सेलुलर गतिविधियों को विज़ुअलाइज़ करना सीएनएस विकार28,29,30 के तंत्र को समझने और संबंधित उपचारों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है31,32,33। माइलिन म्यान, जो उच्च गति की कार्रवाई संभावित चालन के लिए अक्षतंतुओं को लपेटता है और इन्सुलेट करता है, सीएनएस के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। Demyelination को सफेद पदार्थ विकारों में एक हॉलमार्क के रूप में माना जाता है, जैसे कि मल्टीपल स्केलेरोसिस 34। इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी की चोट 35 के बाद, माइलिन मलबे मैक्रोफेज सक्रियण को संशोधित कर सकते हैं, पुरानी सूजन और माध्यमिक चोट 36 में योगदान कर सकते हैं। इसलिए, जीवित माउस मॉडल में न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं के साथ माइलिन म्यान के विवो इमेजिंग में सीएनएस विकारों में गतिशील प्रक्रियाओं को समझने में बहुत मदद मिलती है।
इस प्रोटोकॉल में, घर-निर्मित TPEF-SRS माइक्रोस्कोप की मौलिक सेटअप प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है और माउस रीढ़ की हड्डी के लिए विवो इमेजिंग विधियों में दोहरे-मोडल को पेश किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, TPEF-SRS माइक्रोस्कोप के मूल सेटअप का विस्तार से वर्णन किया गया है। एसआरएस इमेजिंग के लिए, पंप और स्टोक्स बीम अस्थायी रूप से और स्थानिक रूप से ओपीओ के अंदर ओवरलैप किए जाते हैं। हालांकि, माइ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को हांगकांग अनुसंधान अनुदान परिषद द्वारा अनुदान 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6002-19E, N_HKUST603/19E, नवाचार और प्रौद्योगिकी आयोग (ITCPD/17-9) के माध्यम से समर्थित किया गया था।
Materials
| #2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
| 10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
| 25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
| Burn cream | Betadine | ||
| Camera | Sony | α6300 | |
| Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
| Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
| D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
| D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
| Depilating cream | Veet | ||
| FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
| FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
| Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
| Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
| Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
| High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
| Iodine | Betadine | ||
| IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
| Iris | Thorlabs | CPA1 | |
| L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
| L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
| L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
| L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L7 | f=100 mm, AB coating | ||
| L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
| L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
| Lock-in amplifier | APE | ||
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
| Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
| multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
| Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
| Power meter | Newport | 843-R | |
| Saline | Braun | ||
| Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
| Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
| Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
| Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
| Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |
References
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
- Turrell, G., Corset, J. . Raman Microscopy: Developments and Applications. , (1996).
- Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
- Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
- Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
- Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
- He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -. X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
- Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
- Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
- Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
- Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer’s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
- Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
- Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
- Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
- Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
- Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
- van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Lau, S. -. F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
- Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
- Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. . Introduction to Optics. , (2017).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
- Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
- Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
- van Manen, H. -. J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
- Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
