उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी विशिष्ट रासायनिक बांडों के अपने आंतरिक कंपन के आधार पर बायोमोलेक्यूल्स के लेबल-मुक्त इमेजिंग की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में, एक एकीकृत एसआरएस और दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के वाद्य सेटअप को जीवित चूहों की रीढ़ की हड्डी में सेलुलर संरचनाओं की कल्पना करने के लिए वर्णित किया गया है।
उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी आंतरिक आणविक कंपन के आधार पर अपने प्राकृतिक माइक्रोएन्वायरमेंट में जैविक ऊतकों के लेबल-मुक्त इमेजिंग को सक्षम बनाता है, इस प्रकार उपकोशिकीय संकल्प पर जैविक प्रक्रियाओं के विवो अध्ययन के लिए एक आदर्श उपकरण प्रदान करता है। एसआरएस माइक्रोस्कोप में दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति (टीपीईएफ) इमेजिंग को एकीकृत करके, ऊतकों के विवो इमेजिंग में दोहरी-मोडल कई दृष्टिकोणों से महत्वपूर्ण जैव रासायनिक और बायोफिजिकल जानकारी प्राप्त कर सकती है जो सेलुलर चयापचय, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ऊतक रीमॉडलिंग, आदि में शामिल गतिशील प्रक्रियाओं को समझने में मदद करती है। इस वीडियो प्रोटोकॉल में, एक TPEF-SRS माइक्रोस्कोप सिस्टम के सेटअप के साथ-साथ पशु रीढ़ की हड्डी की इन विवो इमेजिंग विधि पेश की जाती है। रीढ़ की हड्डी, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के हिस्से के रूप में, मस्तिष्क और परिधीय तंत्रिका तंत्र के बीच संचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। माइलिन म्यान, फॉस्फोलिपिड्स में प्रचुर मात्रा में, अक्षतंतु को चारों ओर से घेरता है और कार्रवाई क्षमता के नमकीन चालन की अनुमति देने के लिए इन्सुलेट करता है। रीढ़ की हड्डी में माइलिन म्यान के विवो इमेजिंग में न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों और रीढ़ की हड्डी की चोट की प्रगति का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल पशु तैयारी और विवो TPEF-SRS इमेजिंग विधियों में उच्च रिज़ॉल्यूशन जैविक छवियों को प्राप्त करने के लिए भी वर्णन करता है।
रमन माइक्रोस्कोपी 1,2 बायोमोलेक्यूल्स में विभिन्न रासायनिक बांडों की विशेषता आवृत्तियों के आधार पर जैविक ऊतकों की छवि के लिए एक शक्तिशाली लेबल-मुक्त विधि के रूप में उभर रहा है। अपनी गैर-इनवेसिव और अच्छी तरह से अनुकूली इमेजिंग क्षमता के कारण, रमन माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से जैविक ऊतकों में लिपिड-समृद्ध घटकों जैसे माइलिन म्यान 3,4,5, एडिपोसाइट्स 6,7, और लिपिड ड्रॉपलेट्स 8,9,10 में इमेजिंग लिपिड-समृद्ध घटकों के लिए उपयोग किया गया है। . उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) सिग्नल प्रेरित रमन लाभ (एसआरजी) या उत्तेजित रमन हानि (एसआरएल) के रूप में अधिग्रहित पृष्ठभूमि-मुक्त है, जो सहज रमन प्रकीर्णन 11,12 के लिए सही वर्णक्रमीय समानता दिखाता है। इसके अलावा, एसआरएल और एसआरजी रैखिक रूप से विश्लेषक एकाग्रता पर निर्भर हैं, जो जैव रासायनिक घटकों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं9,11,13। दो फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TPEF) व्यापक रूप से अपनी अंतर्निहित ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता, गहरी पैठ गहराई, और कम phototoxicity14,15,16 के कारण विवो जैविक इमेजिंग में के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, TPEF इमेजिंग का प्रदर्शन फ्लोरोसेंट टैग की विशेषताओं पर निर्भर करता है, और ब्रॉडबैंड प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा 8,17,18,19 के कारण समाधान योग्य रंगों की संख्या सीमित है। लेबल-मुक्त एसआरएस इमेजिंग और प्रतिदीप्ति-आधारित टीपीईएफ इमेजिंग दो पूरक इमेजिंग तरीके हैं, और उनका संयोजन ऊतकों की प्रचुर मात्रा में बायोफिजिकल और जैव रासायनिक जानकारी प्रदान कर सकता है। ये दो इमेजिंग तौर-तरीके दोनों नॉनलाइनर ऑप्टिकल (एनएलओ) प्रक्रियाओं पर आधारित हैं, जो एक माइक्रोस्कोप सिस्टम में सरल एकीकरण की अनुमति देता है। एसआरएस और टीपीईएफ इमेजिंग का संयोजन, तथाकथित दोहरी-मोडल इमेजिंग, उच्च आयामी इमेजिंग और कोशिकाओं और ऊतकों की प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाता है, जिससे जटिल जैविक प्रणालियों की व्यापक समझ की सुविधा मिलती है। विशेष रूप से, पिकोसेकंड (पीएस) एसआरएस माइक्रोस्कोपी फेम्टोसेकंड (एफएस) एसआरएस तकनीक 11 की तुलना में उच्च वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन के साथ रासायनिक-बॉन्ड इमेजिंग प्राप्त कर सकती है, जिससे जैविक ऊतक में कई जैव रासायनिक घटकों को अलग करने की अनुमति मिलती है, विशेष रूप से भीड़ भरे फिंगरप्रिंट क्षेत्र में 20,21। इसके अलावा, सुसंगत विरोधी स्टोक्स प्रकीर्णन (CARS) माइक्रोस्कोप के एकीकरण के साथ एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया दोहरी मोडल NLO माइक्रोस्कोप प्रणाली के साथ तुलना में, SRS वर्णक्रमीय और छवि व्याख्या के साथ-साथ पता लगाने संवेदनशीलता 11 के मामले में CARS के लिए बेहतर प्रदर्शन दिखाता है। एसआरएस-टीपीईएफ माइक्रोस्कोप का उपयोग विभिन्न जैविक प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में किया गया है, जैसे कि केनोरहाबडिटिस एलिगेंस 9,22, ज़ेनोफस लेविस टैडपोल ब्रेन 5, माउस ब्रेन 23,24, रीढ़ की हड्डी 25,26, परिधीय तंत्रिका 27, और वसा ऊतक 7, आदि।
मस्तिष्क के साथ रीढ़ की हड्डी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) बनाती है। शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों के तहत विवो में सीएनएस में सेलुलर गतिविधियों को विज़ुअलाइज़ करना सीएनएस विकार28,29,30 के तंत्र को समझने और संबंधित उपचारों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है31,32,33। माइलिन म्यान, जो उच्च गति की कार्रवाई संभावित चालन के लिए अक्षतंतुओं को लपेटता है और इन्सुलेट करता है, सीएनएस के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। Demyelination को सफेद पदार्थ विकारों में एक हॉलमार्क के रूप में माना जाता है, जैसे कि मल्टीपल स्केलेरोसिस 34। इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी की चोट 35 के बाद, माइलिन मलबे मैक्रोफेज सक्रियण को संशोधित कर सकते हैं, पुरानी सूजन और माध्यमिक चोट 36 में योगदान कर सकते हैं। इसलिए, जीवित माउस मॉडल में न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं के साथ माइलिन म्यान के विवो इमेजिंग में सीएनएस विकारों में गतिशील प्रक्रियाओं को समझने में बहुत मदद मिलती है।
इस प्रोटोकॉल में, घर-निर्मित TPEF-SRS माइक्रोस्कोप की मौलिक सेटअप प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है और माउस रीढ़ की हड्डी के लिए विवो इमेजिंग विधियों में दोहरे-मोडल को पेश किया जाता है।
इस प्रोटोकॉल में, TPEF-SRS माइक्रोस्कोप के मूल सेटअप का विस्तार से वर्णन किया गया है। एसआरएस इमेजिंग के लिए, पंप और स्टोक्स बीम अस्थायी रूप से और स्थानिक रूप से ओपीओ के अंदर ओवरलैप किए जाते हैं। हालांकि, माइ?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को हांगकांग अनुसंधान अनुदान परिषद द्वारा अनुदान 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6002-19E, N_HKUST603/19E, नवाचार और प्रौद्योगिकी आयोग (ITCPD/17-9) के माध्यम से समर्थित किया गया था।
#2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
Burn cream | Betadine | ||
Camera | Sony | α6300 | |
Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
Depilating cream | Veet | ||
FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
Iodine | Betadine | ||
IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
Iris | Thorlabs | CPA1 | |
L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L7 | f=100 mm, AB coating | ||
L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
Lock-in amplifier | APE | ||
Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
Power meter | Newport | 843-R | |
Saline | Braun | ||
Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |